2022-11-08
《Redox Biology》
影響因子：10.787
文章題目：CircSV2b participates in oxidative stress regulation through miR-5107-5p-Foxk1-Akt1 axis in Parkinson’s disease
北京大學在《Redox Biology》上發表了CircSV2b通過miR-5107-5p-Foxk1-Akt1軸參與帕金森病氧化應激調節的研究成果。
研究背景
帕金森病（PD）是繼阿爾茨海默病（AD）之后第二種最常見的神經退行性疾病。目前確診PD仍主要依靠患者的癥狀和影像學等方法，具有滯后性，且誤診率較高，探索可用于臨床診斷的低侵入性新型分子標記物，解析標記物參與PD的分子機制，可以為預防PD和開發靶向藥物提供理論基礎。作為一種新型的非編碼RNAs，共價封閉的環狀RNAs（circRNAs）在真核生物中普遍表達。新的研究表明，circRNAs的失調與神經系統疾病有關。然而，circRNAs在PD中的生物生成、調節、功能和機制在很大程度上仍不清楚。
技術路線
研究內容
MPTP成功誘導小鼠PD的發生
連續5天腹腔注射MPTP溶液以創建PD小鼠模型。構建模型后進行行為測試，并收集樣本。如圖1A–C所示，MPTP降低了STR中DA及其代謝物（DOPAC和HVA）的水平。爬桿實驗和步態分析均表明，MPTP治療會損害小鼠的運動平衡（圖1D–F）。MPTP治療降低了SNpc和STR中TH的表達，并損傷了多巴胺能神經元（圖1G–J）。這些結果表明，MPTP減弱多巴胺合成，破壞黑質紋狀體功能，并誘導PD的運動癥狀產生。
圖1 MPTP誘導的小鼠PD模型的驗證
circSV2b作為PD診斷和治療靶點的篩選和鑒定
通過對PD小鼠模型的SNpc和STR組織以及對照組織進行RNA-seq，找到STR組織中存在8個上調和25個下調的circRNAs。聯合qRT-PCR和FISH實驗結果證實，MPTP處理后，circSV2b在SNpc和STR中的表達下調（圖2A-D）。CircSV2b來源于小鼠chr7（qD1）上的SV2b基因，由外顯子5-9在轉錄后通過頭尾剪接形成（圖2E）。使用專門設計的發散引物和收斂引物進行PCR和瓊脂糖凝膠電泳。發現circSV2b對RNase R消化有抗性，而線性SV2b和β-肌動蛋白沒有抗性（圖2F-G）。對circSV2b cDNA PCR產物進行Sanger測序（圖2H），PCR產物的序列和剪接位點與其預測序列一致。
圖2 MPTP誘導的PD小鼠的CircRNA譜分析
circSV2b的過度表達改善了MPTP誘導的小鼠PD癥狀
為了評估circSV2b過表達對PD的保護作用，研究者將小鼠分為4組，通過腺相關病毒（AAV）注射過表達circSV2b、行為學實驗和MPTP注射，結果發現注射AAV導致circSV2b過度表達，并且在MPTP治療后circSV2 b表達保持高水平（圖3A）。爬桿實驗和步態分析都表明，circSV2b的過度表達緩解了運動平衡受損（圖3B）。circSV2b過表達部分恢復了SNpc和STR中MPTP降低的DA水平和TH蛋白水平（圖3C–E）。circSV2b過表達也逆轉了SNpc中TH+神經元數量和STR TH+纖維密度的減少（圖3F-G）。這些結果表明，circSV2b過表達恢復多巴胺合成，維持黑質紋狀體功能，并改善MPTP誘導的PD小鼠的運動功能。
圖3上調circSV2b在MPTP誘導的PD小鼠模型中的神經保護作用
CircSV2b通過ceRNA機制發揮作用
位于細胞質的circRNA發揮作用的主要途徑是作為miRNA的分子海綿（molecular sponges），circRNA可以與相應microRNA結合，像“海綿”吸附miRNA，使miRNA無法與靶基因結合，進而共同參與調控靶基因的表達。作者對N2A細胞進行FISH染色，以及對SNpc組織進行核與質的分離并進行qRT-PCR，確認了circSV2b主要位于SNpc的細胞質中，MPTP處理導致細胞質中的circSV2b顯著減少（圖4A-B）。為了充當分子海綿，circRNA必須與miRNA和AGO2蛋白形成RNA誘導的沉默復合物。熒光共標記實驗結果表明，circSV2b和AGO2共定位（圖4C）。這一發現為這兩種分子的結合提供了空間基礎。分析了3種circRNA- miRNA預測工具（miRanda、TargetScan和RNAhybrid）的重疊結果，并鑒定了13種miRNA（圖4D），且只有3個候選miRNA具有下游靶基因（圖4E）。作者比較了MPTP治療后SNpc組織中候選miRNA的水平，發現MPTP處理后SNpc組織中miR-5107-5p的增加尤為明顯（圖4F）。進一步的RIP和RNA pull-down實驗證實，circSV2b能夠與miR-5107-5p相互作用，具有作為miRNA分子海綿的功能（圖4G-H）。
先前的研究證實Foxk1通過競爭性內源RNA（ceRNA）機制被lncRNA調控。該研究明確了Foxk1在SNpc中表達，并與酪氨酸羥化酶（TH）有協同作用。在N2A細胞中的miR-5107-5p和Foxk1也在細胞質中共定位（圖4I-J）。miRNA與mRNA的結合也取決于AGO2，使用Foxk1探針進行的RNA pull down實驗證實Foxk1確實與AGO2結合。這些結果表明，circSV2b與miR-5107-5p相互作用，miR-5107-5p與mRNA Foxk1相互作用（圖4K）。為了證實生物信息學預測分析，在N2A細胞中應用了雙熒光素酶分析。結果表明，circSV2b與miR-5107-5p相互作用，miR-5107-2p與mRNA Foxk1相互作用（圖L-N）。
圖4 CeRNA預測和circSV2b的靶向驗證
Foxk1是Akt1的一個轉錄因子
由于氧化應激在PD發病機制中的重要作用，研究者使用CUT&Tag技術來篩選Foxk1下游的氧化應激相關靶基因，兩個重復樣本共得到8013個重疊的peak，對peak相關的基因進行GO注釋和富集分析（圖5A-B），發現兩個樣本都在“氧化應激反應”中富集，并且2個樣品中Akt1基因的TTS處均存在peak，其motif序列也與Foxk1的binding motif相一致，表明Foxk1是Akt1的一個轉錄因子（圖5C-D）。
圖5通過CUT&Tag篩選Foxk1的靶基因
circSV2b的過表達通過ceRNA-Akt1途徑抵抗PD的氧化應激損傷
circSV2b過表達使得miR-5107-5p和Foxk1表達分別下調和上調（圖6A）；相反，circSV2b的干擾表達使得miR-5107-5p和Foxk1分別上調和下調（圖6E），且shRNA1的干擾作用最顯著（圖6D）；WB分析顯示Foxk1和Akt1的蛋白水平也發生相應變化（圖6B-C，F-G）。通過一系列其它表達變化相關實驗，證實CircSV2b調節miR-5107-5p的表達，miR-5107-5p影響Foxk1的表達，而Foxk1則影響Akt1的表達（圖7A-F）。作者設計了Foxk1過表達質粒，WB結果表明Foxk1成功過表達，Akt1表達上調（圖7G-H）；另外還設計了3個Foxk1干擾質粒，WB結果表明shRNA3具有最佳的干擾效果（圖7I和J）。因此，它被選擇用于后續實驗。此外，Foxk1表達干擾后，Foxk1和Akt1的表達均下調（圖7K和L）。
圖6 miR-5107-5p的水平由circSV2b調節
圖7 miR-5107-5p調節的Foxk1可以調節Akt1的表達
此外，為探索circSV2b過表達導致抵抗PD的機制，作者評估了ceRNA-Akt1途徑和氧化應激分子中各種分子的表達變化。結果表明，circSV2b的過表達逆轉了MPTP引起的miR-5107-5p的增加，并緩解了Foxk1和Akt 的mRNA及蛋白表達的減少（圖8A-B），并減少了MPTP引起的氧化產物MDA的增加，也提高了抗氧化酶（SOD和GSH-PX）的活性（圖8C-D）。
圖8 circSV2b的上調表達通過ceRNA-Akt1減輕MPTP誘導的氧化應激損傷
研究結論
該研究發現circSV2b可以作為診斷PD的一種生物標志物，通過多種生化、分子、組學等嚴謹的實驗和數據分析，發現circSV2b的過表達可以防止MPTP條件下SNpc中多巴胺能神經元的神經變性和氧化壓力損傷（圖9），circSV2b對PD的良好的神經保護作用可能主要是由miR-5107-5p-Foxk1-cAkt1軸介導的，使其成為治療PD的一個新型靶標。
圖9 circSV2b在MPTP誘導的PD中的作用機制示意圖
本研究的轉錄組測序和部分數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。
原文索引：
Cheng Q, Wang J, Li M. et al. CircSV2b participates in oxidative stress regulation through miR-5107-5p-Foxk1-Akt1 axis in Parkinson's disease. Redox Biol. 2022 Oct;56:102430. doi: 10.1016/j.redox.2022.102430.
