2022-10-24
《Microbiology Spectrum》 影響因子：9.043
近日，上海交通大學在生物學領域的《Microbiology Spectrum》發表新研究成果！本研究對來自中國16個省份的5287株沙門氏菌進行了大規模的回顧性篩選，以闡明S. Indiana（印第安沙門氏菌分離株）的全國流行情況和系統發育學特征。系統進化分析表明，ST17菌株可分為四個分支，并出現了國際傳播的現象；此外，本研究還探討了遺傳因素對該病原體耐藥性的影響。這些尚未被報道的多重耐藥的ST17型S. Indiana菌株在中國的流行情況和基因組特征的發現，為這種高度耐藥的ST17型菌株的潛在風險提供了有價值的見解。
一、研究背景 沙門氏菌病是世界上最常見的食源性疾病之一，對公眾健康構成嚴重威脅。在2600多個沙門氏菌血清型中，S. Indiana近年來已成為中國最流行的血清型之一。S. Indiana在畜牧場肉雞中的流行從2010年的15%增加到2014年的70%，而且近年來在腹瀉患者中發現了這種病原體。氟喹諾酮類藥物和頭孢菌素類藥物通常被用作沙門氏菌病治療的一線藥物，環丙沙星和頭孢曲松分別是氟喹諾酮類和頭孢菌素類的代表性抗生素。然而，環丙沙星和頭孢曲松聯合耐藥的S. Indiana分離株已經出現，并在零售肉類和患者中流行。此外，這些分離株通常是耐多藥的（MDR）。人們現在正面臨著來自S. Indiana MDR日益增長的威脅，揭示該病原體的流行病學和進化特征以及抗生素耐藥性機制至關重要。 迄今為止，一些常規方法，如PCR、脈沖場凝膠電泳（PFGE）和多點序列分型（MLST）已被用于研究S. Indiana的流行情況。然而，傳統的監測使得很難獲得已經擴大的S. Indiana的主要傳播動態。目前，全基因組測序已被廣泛應用于揭示細菌的進化動態。因此，本研究對來自中國16個省份的5287株血清型沙門氏菌進行了大規模的回顧性篩選，以闡明S. Indiana的全國流行情況、系統發育結構和進化特征，并探討了遺傳因素對該病原體耐藥性的影響。
二、研究材料與方法 1、實驗材料 5287株沙門氏菌分離株 2、測序平臺 Illumina + PacBio 3、分析內容 細菌基因組完成圖測序、抗生素抗性基因分析、插入序列分析、轉座子分析、MLST分析、進化樹構建、比較基因組圈圖。
三、研究結果 1. ST17型S. Indiana的分布情況 從16個省中的15個省的食品、患者、健康攜帶者和環境中分離出5287株血清型沙門氏菌，共分離出466株（8.81%）S. Indiana分離株。在466株分離株中，407株（87.3%）被鑒定為ST17，其余的（12.7%）為ST2040。ST17分離物的檢測陽性率（87.3%）低于先前研究（100.0%），可能是由于ST2040分離物的出現。S. Indiana ST2040以前從未報道過，需要進一步研究其流行率和生物學特性。 在本研究中，食品樣本（64.4%；262/407）是ST17分離物的主要來源。從雞肉中分離得到186株分離株（45.7%），其次是鴨（9.8%）和豬肉（3.7%），表明雞是S. Indiana ST17的主要媒介。除食品外，在健康攜帶者中發現了13.5%的ST17菌株。健康的S. Indiana攜帶者沒有癥狀，無法及時接受治療，可能會加速S. Indiana在人類中的傳播。此外，15.2%的ST17菌株是從腹瀉患者中回收的，這些患者大多是免疫力低下的兒童或老年人。 圖1：S. Indiana ST17分離株的國內流行情況 2. ST17型S. Indiana的多重耐藥 在本研究中，407株S. Indiana ST17菌株中有366株（89.9%）對環丙沙星耐藥，280株（68.8%）對頭孢曲松耐藥，235株（57.7%）菌株同時對環丙沙星和頭孢曲松耐藥。更重要的是，共有372株（91.4%）ST17菌株被鑒定為耐多藥菌株。ST17分離株的高MDR率與先前研究（91.1%）一致。S. Indiana ST17分離株中的高水平MDR，尤其是環丙沙星和頭孢曲松的聯合耐藥性將大大增加患者臨床治療的挑戰。目前，其他國家的S. Indiana分離株對大多數常見抗生素相對敏感。與其他國家相比，S. Indiana的高水平抗生素耐藥性似乎是中國特有的現象，這可能是由于中國廣泛使用抗生素所致。 圖2：2002年-2018年S. Indiana ST17分離株中環丙沙星和頭孢曲松的耐藥情況 3. S. Indiana ST17分離株在國際中傳播 本研究對來自中國的171個基因組和來自其他12個國家的公共數據庫中的470個基因組進行了系統發育分析。在這641株S. Indiana分離株中共鑒定出6種STs型：ST17、ST2040、ST3480、ST3558、ST5311和ST5449，其中ST17和ST2040是主要類型。與ST2040分離株相比，ST17分離株在歐洲、北美和東南亞的13個國家廣泛傳播，并持續多年。 系統發育學結果表明，ST17分離株可能早期出現在美國，然后在愛爾蘭和英國進化，最后在國際上分為四個分支（I、II、III和IV）。分支I由2014年至2020年間來自英國的250個分離株組成；分支II是一個混合簇，由來自荷蘭、德國和英國的歐洲分離株組成，表明它們的遺傳關系密切；分支III由來自美國和英國的分離株組成，它們的進化路徑意味著可能會從英國在美國大規模引入，然后在全國范圍內傳播；此外，2006年至2018年期間，來自中國的ST17分離株屬于第四分支，來自英國的4個人類分離株也屬于第四分支。還有來自不同國家的其他分離株來源于第四分支，這表明它們與中國的分離株有密切的遺傳關系。 圖3：S. Indiana分離株的進化研究 4. GyrA、ParC和PMQR基因發生突變 在中國分離物中發現，GyrA-ParC（84.8%）、aac（6’）-Ib-cr（62.0%）和oqxAB（29.8%）的PMQR基因突變頻繁。GyrA的QRDR突變常見為S83F/D87N和S83F/D87G，其次是S83F和D87G。ParC的突變常見為T57S/S80R，其次為T57S。與S. Enteritidis和S. Typhimurium相比，S. Indiana分離株在GyrA和ParC中具有更多的位點突變。此外，還發現源自中國的S. Indiana分離株的GyrA和ParC突變率顯著高于來自英國、美國和德國的突變率，而QRDR和PMQR基因的突變是導致革蘭氏陰性細菌對環丙沙星敏感性降低的主要原因。這些結果表明，GyrA和ParC以及PMQR基因的突變經常在中國的S. Indiana ST17中發現，這可能是本研究中環丙沙星耐藥性水平較高的原因之一。 5. 多基因突變導致ST17分離株對環丙沙星高度耐藥 通過對重建的系統發育樹的分析，中國ST17分離株中QRDR存在多個位點突變，并伴隨著顯著的克隆擴增。特別是，在ST17克隆的基礎分離物中，GyrA（S83F或D87N）發生單一突變，GyrB（S83F/D87N或S83F/D87G）發生雙突變，ParC（S80R）發生額外突變。類似地，系統發育分析表明，早期突變發生在GyrA（S83F），隨后是ParC（S80I）突變。這些研究結果表明，GyrA和ParC位點突變的增加可能通過增強其抗生素耐藥性從而促進S. Indiana ST17的傳播。 圖4：中國S. Indiana ST17菌株的系統發育樹 GyrA和ParC突變是在易感野生型分離株中構建，通過同源重組產生PML1、PML2、PML3和PML4的突變體，以檢測它們在環丙沙星耐藥性形成中的作用。生長曲線的結果表明，GyrA和ParC的突變對PML1-4的生長速率沒有顯著影響；GyrA的單突變或GyrB的雙突變導致環丙沙星的MIC從0.015 mg/mL增加到0.25 mg/mL；PML4的三重突變導致環丙沙星的MIC更高（8mg/mL）。 通過將PMQR基因oqxAB克隆到pMD19-T載體中構建重組質粒pMDoqxAB，PML6、PML7和PML8。與野生型菌株SJTUF14139相比，PML5、PML6、PML7和PML8的生長速率較低，這可能是由于引入pMDoqxAB的適應成本造成的。與PML1-4相比，環丙沙星對PML5-8的MIC增加了4-8倍；環丙沙星對PML5、PML6和PML7的MIC至少達到1mg/mL，這表明GyrA（S83F和/或D87N）突變與oqxAB結合可使環丙沙星的MIC達到最高值。以上結果表明環丙沙星對ST17分離株的高水平MIC是由GyrA-ParC和PMQR基因突變的聯合作用造成的。 6. ST17分離株IncHI2-IncHI2A質粒上有多個抗生素抗性基因 ST17分離株中存在多種類型的質粒，在本研究中，IncHI2-IncHI2A質粒在中國S. Indiana分離株中最常見，占68.4%。此外，p14154A與我們先前報道的質粒p87912和p13520高度相似（圖5a）。這三種質粒的宿主來自不同的地方，表明這些質粒可能從同一祖先進化而來。 圖5：S. Indiana的質粒序列特征和遺傳排列 在質粒p14154A耐多藥區（MRR）中共發現26個ARG。之前的研究表明攜帶多個ARG的IncHI2-IncHI2質粒在S. Indiana的MDR中起著重要作用。此外，blaCTX-M-65、mphA、qepA、oqxAB、blaOXA-1、fosA3和rmtB的ARG在質粒p14154A中分布有不同的ISs和轉座子（Tns）。研究表明，大多數MRR具有鑲嵌結構，表明在S. Indiana ST17中MRR的形成涉及通過同源重組或移動元件的轉位獲得和多個ARG決定簇的逐步整合。 7. ST17分離株中存在攜帶Tn1721-blaCTX-M-27的P1-like噬菌體質粒 在本研究中，9株ST17菌株被鑒定為具有P1-like復制子基因，6株ESBL基因blaCTX-M-27呈陽性，這在其他菌株中很少見。從SJTUF14146分離株中提取質粒p14146是P1-like噬菌體質粒，并與腸桿菌噬菌體P1具有高度相似的序列結構（圖5b）。此外，攜帶blaCTX-M-27的Tn1721單元整合到p14146中，其側翼有兩個6 bp的正向重復序列（TATGAA），表明發生了轉位事件（圖5c）。研究表明blaCTX-M-27經常位于S. Indiana ST17的Tn1721轉座子原件中，意味著Tn1722可能通過轉座子促進blaCTX M-27基因的水平轉移。 8. 中國ST17分離株中存在多個blaCTX-M變異體 從中國分離株中分別鑒定了ESBL基因blaOXA-1（106個）、blaCTX-M（89個）和blaTEM-1B（36個）。此外，本研究共鑒定了7個blaCTX-M變異體，除了blaCTX-M-65和blaCTX-M-14其余變異體都來自中國的ST17。這些blaCTX-M基因通常位于質粒上，這可能有助于通過腸桿菌科之間的結合快速提升頭孢曲松耐藥性。 基因blaCTX-M-65經常與上游的轉座元件DISEcp1和下游的IS903B相連，該轉座單元約為4.9k bp。在p14154A中發現，blaCTX-M-65上游被IS26截斷而截短的DISEcp1。相反，在blaCTX-M-14和blaCTX-M-123的轉座子單元中發現了完整的ISEcp1元件，插入了完整元件ISVsa5和IS1R的上游。研究表明，ISEcp1是與blaCTX-M基因相關的最常見的移動元件，它可能在S. Indiana的blaCTX-M基因水平轉移中起關鍵作用。
四、結 論 本研究對S. Indiana ST17克隆的大規模出現和國際傳播進行了系統的描述，這在以前沒有報道過。在來自中國的ST17克隆中發現了包括環丙沙星和頭孢曲松在內的高水平耐多藥性，這可能與它們在GyrA、ParC以及質粒的PMQR基因和ESBL基因中多個ARG中的高突變有關。本研究表明，必須采取必要的策略來防止這種高風險MDR ST17克隆的進一步傳播。因此，中國政府已經出臺規定，禁止家畜養殖場和醫院過度使用抗生素，并加強細菌耐藥性的教育和宣傳。
本研究的denovo測序和部分分析由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。如需進一步討論，歡迎發郵件或者致電我們喲（郵箱地址：[email protected]，聯系電話：025-56165883-832）！
文章索引：Zhang, Z. F., Chang, J., Xue, X. B., et al. Phylogenomic Analysis of Salmonella enterica Serovar Indiana ST17, an Emerging Multidrug-Resistant Clone in China. Microbiology Spectrum (2022). https://doi.org/10.1128/spectrum.00115-22
