2022-10-18
《Emerging Microbes & Infections》 影響因子：19.568
中國醫科大學附屬第一醫院在國際著名雜志《Emerging Microbes & Infections》發表了MYOC在新生隱球菌侵入大腦時的作用機制。
技術路線
研究背景 侵襲性真菌病每年導致100多萬人死亡，主要由白色念珠菌、煙曲霉菌和新生隱球菌引起。其中隱球菌性腦膜腦炎(CM)如果不治療，死亡率為100%，真菌的CNS播散在感染過程中是致命，但目前尚缺乏體內或臨床研究闡明隱球菌的CNS播散機制。前人研究表明，新生隱球菌的感染擾亂了小鼠的細胞骨架通路，但是目前還沒有證據表明細胞骨架與隱球菌播散性腦炎之間的機制。鑒定細胞骨架與真菌感染之間的關系可能會發現真菌發病的新機制，并為開發真菌病治療藥物提供靶點。
研究材料與方法 六只雌性獼猴和小鼠（對照組：PBS，處理組：新生隱球菌） 2、測序平臺 Illumina NextSeq 500 3、分析方法 miRNA和mRNA測序，RT-qPCR，WB，FCM，CFU測定等 研究結果
本研究對獼猴和小鼠感染模型分離的肺組織進行了miRNA轉錄組分析(圖1)。病理觀察到了獼猴和小鼠肺組織中新生隱球菌的莢膜結構(圖2A、B)。提取獼猴和小鼠肺組織的總RNA做miRNA測序，分別鑒定出1038和1166個miRNA。對miRNA進行PCA分析(圖2C、D)。然后利用DESeq軟件分析差異miRNA，并對差異miRNA繪制熱圖，其中獼猴中有32個差異miRNA(4個下調和28個上調)，小鼠中有29個差異miRNA (5個下調和24個上調)(圖2E、F)。 圖1動物感染和RNA測序流程圖 圖2獼猴和小鼠miRNA測序分析 2.miRNA-mRNA聯合分析獲得宿主的核心反應 為了模擬人類感染隱球菌的反應，進行了同源分析（圖3A），在感染新生隱球菌的獼猴和小鼠中找到了8個共調節的miRNAs。隨后對這個8個miRNAs進行了RT-qPCR驗證，結果與miRNA測序結果一致（圖3B，C，D）。 隨后對這8個miRNA預測了靶基因，并構建了miRNA-mRNA網絡，該網絡共有223個靶基因（圖3E），對其進行了KEGG和GO分析（圖4）。與免疫系統、肺部疾病和傳染病有關的KEGG通路都顯著富集，GO分析發現，涉及細胞因子活性、組蛋白、免疫細胞、單核細胞、骨髓白細胞和細胞周期的GO term都顯著富集（圖4）。此外，另一顯著富集的是肌動蛋白結合和微管及其相關復合體，它們構成了細胞骨架系統，表明細胞骨架在隱球菌感染中具有潛在功能。 圖3 miRNA-mRNA核心調控網絡 圖4 共調節miRNAs-mRNAs GO分析 3.巨噬細胞 "Trojan Horse "在HIV/AIDS患者中的作用增強，并可被細胞骨架途徑抑制劑所抑制 免疫細胞骨架功能障礙是HIV/AIDS患者的主要病理特征之一，而HIV/AIDS是CM的主要人群。對100例HIV/AIDS患者和200例健康者進行了PSM比較，發現HIV/AIDS患者的單核細胞數量和百分比顯著增加(圖5B)。為了揭示宿主細胞骨架功能，比較了9名HIV/AIDS患者和8名健康者的MDM吞噬和遷移(圖5A)。結果表明HIV/AIDS患者的吞噬能力增強(圖5C)，遷移沒有變化，但MDM遷移與吞噬能力呈正相關(圖5D)。 為了證實HIV/AIDS患者中新生隱球菌感染與細胞骨架的作用關系，使用了細胞骨架途徑抑制劑R10015，將TDM和MDM用R10015預處理2小時，洗凈后與新生隱球菌孵育過夜。發現R10015抑制THP-1細胞系(TDMs)和單核-巨噬細胞(MDMs)的吞噬能力和遷移(圖5E、F和G、H)。然而，R10015不影響TDMs和MDMs的殺傷能力(圖5I、J)。這些結果證實了細胞骨架在巨噬細胞“Trojan Horse”中的重要作用。 圖5 HIV/AIDS患者的巨噬細胞“Trojan Horse”增強 4.MYOC通過調節巨噬細胞“Trojan Horse”抑制新生隱球菌中樞播散 為了確定新生隱球菌感染期間細胞骨架的功能，選擇了與細胞骨架相關的基因肌纖蛋白。肌纖蛋白是由MYOC編碼的，它是miRNA-mRNA調控網絡的核心之一，在獼猴和小鼠的新生隱球菌感染期間顯著下調（圖6A、B）。此外，MYOC的表達在HIV/AIDS患者中也有所上升（圖6C）。 為了探索MYOC的功能，構建了過表達MYOC細胞系，并通過RT-qPCR和WB對其進行定量分析，與mock細胞相比，MYOC在mRNA和蛋白水平上分別有10倍和2倍的增長(圖6D、E、F)。隨后檢測了MYOC細胞系的吞噬、遷移和殺傷能力(圖6G、H、I、J)。通過流式細胞術或共聚焦掃描檢測發現，MYOC過表達時TDM中的吞噬效率顯著增加(圖6G、H、I)。通過CFU檢測到的活菌更少，表明MYOC過表達也增強了殺傷能力(圖6J)。 為了評估MYOC在體內的功能，作者制備了MYOC轉基因小鼠(圖7A)，并利用PCR驗證(圖7B)。與野生型小鼠相比，MYOC轉基因小鼠的腦內CFU均增加(圖7C)。雌性小鼠肺中的CFUs減少，而雄性組無變化(圖7D)。同樣觀察到的是，在生存試驗中，MYOC轉基因小鼠的生存時間比野生型小鼠短(圖7E)。 圖6 MYOC增強新生隱球菌介導的巨噬細胞“Trojan Horse” 圖7 在MYOC轉基因小鼠中MYOC增強了新生隱球菌感染中樞的過程
小 結
本研究使用獼猴模型來模擬人類的反應，并通過構建miRNA-mRNA調控網絡發現細胞骨架通路是新生隱球菌在獼猴和小鼠模型中調控感染的核心通路。此外，臨床免疫細胞檢測證實了HIV/AIDS患者的巨噬細胞“Trojan Horse”的增強，而細胞骨架通路的干預則破壞了“Trojan Horse”。細胞骨架相關基因MYOC被證實是“Trojan Horse”的重要靶點。綜上，這些發現揭示了真菌侵襲中樞神經系統的新調控因子，并可能有助于開發新的抗真菌治療方法。
