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IF 6.064！真菌基因組denovo測(cè)序+比較基因組學(xué)分析助力豬肚菇基因組特征研究

2022-10-10

《Frontiers in Microbiology》

影響因子：6.064

近日，上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院在微生物領(lǐng)域的《Frontiers in Microbiology》發(fā)表新研究成果！本研究對(duì)馴化得到的新型菌豬肚菇進(jìn)行了全基因組測(cè)序，并結(jié)合其他已發(fā)表真菌基因組進(jìn)行了比較基因組學(xué)分析。本研究不僅有利于豬肚菇的基因組輔助育種，而且有助于了解食用菌的耐高溫能力。

研究背景

Pleurotus giganteus是一種烹飪食用菌，由于其外形類似于豬胃，因此在中國(guó)被稱為“豬肚菇”。豬肚菇是一種木材腐爛真菌，以木屑和棉籽殼為主要生長(zhǎng)基質(zhì)，土壤套管法是這種蘑菇果實(shí)生產(chǎn)的主要方法。由于該物種富含營(yíng)養(yǎng)素和生物活性化合物，如多糖、尿苷、脂類和阿魏酸酯酶，具有神經(jīng)原突起生長(zhǎng)、抗氧化、抗癌、抗腫瘤、肝保護(hù)和淀粉酶抑制活性，因此也被視為一種多功能食品補(bǔ)充劑。這種蘑菇的生物活性化合物和交配系統(tǒng)已經(jīng)研究多年，然而，由于缺乏基因組信息，分子和遺傳學(xué)方面研究很少。本研究通過高通里測(cè)序?qū)ωi肚菇進(jìn)行高質(zhì)量的從頭基因組組裝，同時(shí)對(duì)其基因組與其他23種已發(fā)表的真菌基因組進(jìn)行了比較分析。后續(xù)還分析了該基因組的重復(fù)序列、碳水化合物活性酶、木質(zhì)纖維素降解酶、交配等相關(guān)基因。豬肚菇基因組序列的高質(zhì)量組裝對(duì)了解這種重要食用菌的分子機(jī)制和進(jìn)化提供了幫助。

研究材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料：野生豬肚菇菌株馴化而來的“Shen Xun 1 Hao”

2.測(cè)序平臺(tái)：Illumina NovaSeq，PacBio

3.分析內(nèi)容：真菌基因組近完成圖，ANI分析，基因家族分析、單拷貝基因進(jìn)化樹構(gòu)建、共線性分析等

研究結(jié)果

1.豬肚菇培養(yǎng)及單核品系的分離

在S1原基階段，菌絲體扭結(jié)形成子實(shí)體；S2生長(zhǎng)期為原基形成后的持續(xù)生長(zhǎng)期；S3期為伸長(zhǎng)期，子實(shí)體繼續(xù)生長(zhǎng)，直到此階段形成漏斗；S4為收獲期，此時(shí)子實(shí)體生長(zhǎng)到70 - 80%成熟，蓋呈漏斗狀；成熟期S5，子實(shí)體完全成熟，蓋呈大漏斗狀。從“Shen Xun 1 Hao”品系的原生質(zhì)中分離出的單核菌株豬肚菇2。

圖1 豬肚菇生長(zhǎng)周期和形態(tài)學(xué)鑒定

2.豬肚菇基因組組裝及注釋

豬肚菇基因組大小為40,035,591bp，最長(zhǎng)contig長(zhǎng)度為4.384 Mbp，GC含量為50.5%，重復(fù)序列占比11.36%，其中以LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（5.01%）為主，BUSCO完整度為94.2%。豬肚菇基因組共預(yù)測(cè)出12,628個(gè)基因，平均序列長(zhǎng)度為1761bp。其中有9801個(gè)（77.6%）和5494個(gè)（43.5%）基因分別在EggNOG數(shù)據(jù)庫和SwissProt數(shù)據(jù)庫中注釋到，7802個(gè)（61.8%）基因在Pfam數(shù)據(jù)庫被注釋到，以上結(jié)果表明本次測(cè)序得到一個(gè)高質(zhì)量的豬肚菇基因組。

圖2 豬肚菇基因組圈圖

表1 基因組組裝和注釋

表2 重復(fù)序列分析結(jié)果

3.比較基因組分析

為了確定豬肚菇的進(jìn)化關(guān)系，對(duì)其和23種真菌（21個(gè)擔(dān)子菌屬和2個(gè)子囊菌屬）的全基因組序列進(jìn)行了比較分析。基于保守的單拷貝同源基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，豬肚菇與其他側(cè)耳屬植物具有密切的進(jìn)化關(guān)系。側(cè)耳屬植物的菌株聚為兩個(gè)主要的分支，豬肚菇、 P. tuber-regium、P. citrinopileatus和P. salmoneostramineus組成一個(gè)分支，其余7種菌組成另一個(gè)清晰的分支。

圖3 基因家族分析

圖4 基于單拷貝基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹

為了進(jìn)一步驗(yàn)證進(jìn)化關(guān)系，用ANI分析來估計(jì)側(cè)耳屬菌株之間的基因組差異和親緣性。物種樹中的B級(jí)側(cè)耳物種彼此之間以及A級(jí)側(cè)耳種群之間的基因組相似性較低（74%至75%），而A區(qū)物種之間的基因組相似性較高（85%至100%）。綜上所述，上述結(jié)果證實(shí)了根據(jù)目前的分類，豬肚菇屬于側(cè)耳屬。

根據(jù)共線性結(jié)果可知，contig 5和contig 13可能屬于同一染色體，contig 9、14和15可能屬于相同染色體，而contig 12、16、17和20可能屬于相同的染色體。與雙孢梭菌的染色體相比，在豬肚菇的第5、第8、第15、第9、第3染色體上發(fā)現(xiàn)了斷裂和融合事件。與系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果相一致的是，豬肚菇和雙孢菌之間的斷裂和融合事件多于平菇和豬肚菇之間的破裂和融合事件。

圖5 ANI分析和共線性分析

3.CAZymes注釋

CAZymes是真菌基因組中最重要的基因家族之一，負(fù)責(zé)木質(zhì)纖維素降解和許多其他生物過程。使用Hmmer軟件在豬肚菇基因組中共鑒定出514個(gè)CAZymes，包括232個(gè)GHs、72個(gè)GTs、23個(gè)PLs、27個(gè)CE、139個(gè)AAs和21個(gè)CBMs。不同的CAZymes數(shù)目可能是由基因預(yù)測(cè)方法、基因組結(jié)構(gòu)變異和比對(duì)參數(shù)有關(guān)。可以肯定的是，與側(cè)耳屬的其他成員一樣，豬肚菇也具有強(qiáng)大的木質(zhì)纖維素降解能力。此次分析結(jié)果與生產(chǎn)工藝一致，可以利用不同的木質(zhì)纖維素物質(zhì)生產(chǎn)巨菇子實(shí)體。豬肚菇有139個(gè)AA類蛋白質(zhì)，主要分布在AA3、AA9、AA7、AA5、AA1和AA2家族。AA3和AA9類蛋白質(zhì)與纖維糖和半纖維素的降解有關(guān)。木質(zhì)素降解酶，如蟲漆酶和錳過氧化物酶，屬于AA1和AA2類。在SwissProt數(shù)據(jù)庫中，共注釋到了15個(gè)蟲漆酶和10個(gè)II類過氧化物酶，這些酶在植物細(xì)胞壁成分的降解中起著關(guān)鍵作用。因此，結(jié)果表明該菌株的木質(zhì)纖維素降解能力較強(qiáng)，這與子實(shí)體生產(chǎn)中使用的木質(zhì)材料一致。

圖6 豬肚菇和其他23種真菌中的碳水化合物活性酶分析

4.交配型位點(diǎn)識(shí)別

以平菇PC9和杏鮑菇ATCC 90797中的交配型基因作為參考序列，對(duì)豬肚菇的配種位點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)。豬肚菇A配種位點(diǎn)位于contig1上。該位點(diǎn)的總長(zhǎng)度超過4kb，由兩個(gè)大小相似的同源域基因（HD）組成。與平菇PC9和豬肚菇不同，杏鮑ATCC 90797有一個(gè)HD1基因和一個(gè)HD2基因以相反的方向轉(zhuǎn)錄，另外一個(gè)額外的HD2基因位于HD1的另一側(cè)。該氨基酸序列與平菇PC9和杏鮑菇ATCC 90797中HD1的序列相似性分別為52.7%和51.1%。HD2與菌株P(guān)C9和ATCC 90797的序列相似性分別為57.4%和50.0%（49.5%）。四個(gè)信息素受體基因（STE3.1-STE3.4）和三個(gè)信息素基因（PHB3.1-PHB3.3）被預(yù)測(cè)并聚集在一個(gè)～45 kb基因簇。TMHMM預(yù)測(cè)顯示，所有四個(gè)信息素受體都包含7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。B配種位點(diǎn)的基因結(jié)果與杏鮑菇和白靈菇中的不同，這表明B交配型位點(diǎn)是通過基因組重排的多重事件進(jìn)化而來的，如金針菇和香菇中的基因組重排事件。本文所提供的信息對(duì)發(fā)展豬肚菇雜交的分子標(biāo)記具有重要意義。

圖7 豬肚菇配種位點(diǎn)的基因結(jié)構(gòu)

結(jié)論

本研究第一次報(bào)道了豬肚菇的全基因組序列，通過完整性及共線性分析表明基因組組裝質(zhì)量高。通過比較基因組分析，證實(shí)了該菌應(yīng)歸為側(cè)耳屬。全基因組測(cè)序研究發(fā)現(xiàn)該豬肚菇具有較強(qiáng)的木質(zhì)纖維素降解能力、可用于品系鑒定和育種中分子標(biāo)記開發(fā)。豬肚菇的基因組組裝為該品種蘑菇的栽培、營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值的基礎(chǔ)研究提供了見解。

本研究的真菌基因組測(cè)序和部分分析由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。如需進(jìn)一步討論，歡迎發(fā)郵件或者致電我們喲（郵箱地址：[email protected]，聯(lián)系電話：025-56165883-832）！

文章索引：

Yu H, Zhang M, Sun Y, et al. Whole-genome sequence of a high-temperature edible mushroom Pleurotus giganteus(zhudugu)[J].Frontiers in Microbiology,2022,13:941889.

doi: 10.3389/fmicb.2022.941889

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