2022-09-13
Molecular Therapy: Nucleic Acids
影響因子：10.183
文章題目：Filamin C regulates skeletal muscle atrophy by stabilizing dishevelled-2 to inhibit autophagy and mitophagy 技術手段：RNA-seq等
四川農業大學在Molecular Therapy: Nucleic Acids上發表了Filamin C通過穩定dishevelled-2抑制細胞自噬和線粒體自噬來調節骨骼肌萎縮的研究成果
1、研究背景
FilaminC (Flnc)是肌動蛋白結合蛋白家族的成員，在心臟和骨骼肌組織中優先表達。雖然已知它與肌纖顫性肌病相關的蛋白質相互作用，但其在骨骼肌中的獨特作用仍很大程度上是未知的。因此，本研究分別利用雞原代成肌細胞和動物模型對Flnc的體內外生物學功能進行了鑒定。
2、研究路線
3、研究內容
1.Flnc在肥厚型肉雞中表達上調，并在骨骼肌分化中發揮作用 為了篩選調控肌肉發育的候選基因，研究測定了Ross 308肉雞和白來亨肉雞的胸肌轉錄組。在12744個表達的基因中，有869個基因在兩個品種中顯著差異表達，如Stac3、Klf5、MyoG、Nexn、Myot和MyH7，它們是調控肌肉發育的標志性基因(圖1A)。然后，實驗通過qPCR驗證骨骼肌發育的基因特征(圖1B)。生長快的雞的Flnc表達比生長慢的雞高50倍。隨后，我們發現Flnc主要在骨骼肌和心肌中表達(圖1C)。此外，Flnc在維持心肌和骨骼肌結構完整性方面發揮著重要作用。MyoD免疫熒光染色鑒定原代成肌細胞(圖1D)。qPCR分析顯示，Flnc mRNA在雞肌管中的表達高于雞成肌細胞(圖1E)。通過qPCR和western blotting，我們還發現，在成肌細胞分化為肌管的過程中，Flnc的表達逐漸增加(圖1F和1G)。 圖1 Flnc在骨骼肌分化中的作用 2.Flnc促進成肌細胞分化以及挽救骨骼肌萎縮 為了探索Flnc在肌源分化過程中的作用，研究通過轉染Flnc siRNA來降低雞成肌細胞中Flnc mRNA和蛋白的表達(圖2A-2C)，并用過表達Flnc的質粒轉染細胞，實現了Flnc過表達。結果顯示，Flnc沉默促進增殖，抑制凋亡，而Flnc過表達抑制增殖，促進凋亡。提示Flnc可減少成肌細胞數量，影響肌源性分化。 實驗進一步研究了Flnc對原代肌管中萎縮相關基因的影響，結果表明，Flnc可能有助于調節肌肉萎縮相關基因的表達，并治療地塞米松誘導的肌管萎縮（圖3）。接下來，研究在體內測試了Flnc對肌肉發育的影響，結果提示，Flnc可能參與調節肌肉萎縮和肥厚。 圖2 Flnc敲除/過表達對成肌細胞的影響 圖3 Flnc對骨骼肌萎縮的影響 3.Flnc通過Dvl-2介導的Wnt/b-catenin信號通路發揮作用 通過RNA測序分析分化3天后Flnc沉默細胞和對照細胞，探討Flnc在成肌細胞分化中的分子機制。在成肌細胞分化過程中，肌形成相關基因的表達顯著降低，而Flnc siRNA抑制了這些基因的表達(圖4A)。同時，qPCR證實肌源性和Wnt信號通路靶基因mRNA表達顯著下調(圖4B)。差異表達基因(DEGs)的GO功能注釋分析，鑒定出參與肌肉細胞調控和發育、肌肉組織形態發生和肌纖維發育的基因(圖4C)。KEGG通路分析表明，DEGs明顯參與MAPK和wnt信號通路。Wnt信號通路與肌細胞分化密切相關(圖4D)。為了檢測Flnc對Wnt信號的調控作用，通過系列實驗進行驗證，結果說明Flnc對Wnt信號的調控需要Dvl2的調節。 圖4 敲低Flnc可抑制Wnt/b-catenin信號通路 4.Flnc通過與Dvl2結合抑制自噬 自噬通過調節散亂降解負向調控Wnt信號通路，用3MA處理Flnc沉默的成肌細胞和對照細胞結果顯示，Flnc沉默的成肌細胞中Dvl2增加(圖5E)。免疫沉淀分析顯示內源性Flnc與Dvl2相互作用，此外，在Flnc沉默的細胞中，Dvl2的泛素化明顯增加(圖5H和5I)，這表明Flnc可以阻止Dvl2泛素化，也可以抑制自噬小體的正確形成。這些結果表明，Flnc穩定了Dvl2介導的Wnt/b-catenin信號通路來拮抗自噬。 圖5 Flnc與Dvl2相互作用拮抗自噬 5.Flnc沉默誘導的自噬通過線粒體清除介導肌肉萎縮 通過電鏡觀察，觀察到Flnc沉默后自噬小體增加，線粒體大量增加。然后我們研究了線粒體自噬是否參與了Flnc沉默引起的肌肉萎縮，發現線粒體膜電位在Flnc沉默24 h后下降(圖6A)。此外，與對照組相比，Flnc沉默細胞的耗氧量和ATP生成顯著增加(圖6B和6C)。研究進一步評估了Flnc在線粒體融合中的作用。Flnc沉默增加了線粒體裂變蛋白dynamin 1-like蛋白的表達(圖6D和6E)。實驗還研究了自噬和線粒體碎片是否與選擇性線粒體降解有關。結果表明，與對照組相比，Flnc沉默顯著促進了溶酶體-線粒體的共定位，在地塞米松處理損傷的細胞中，線粒體自噬也增加了(圖6F)。這提示Flnc沉默引起的肌肉萎縮可能是由線粒體自噬介導的。 圖6 Flnc沉默誘導自噬，通過線粒體清除介導肌肉萎縮
4、結 論
通過實驗發現，速生雞(肉雞)骨骼肌的生長速度和質量顯著高于慢生雞(蛋雞)，Flnc在肉仔雞骨骼肌中的表達量高于蛋雞。研究結果表明，Flnc在肉雞骨骼肌中表達量較高，尤其是骨骼肌中表達量高于蛋雞。這表明Flnc在成肌細胞的發育中起著積極的調控作用。在動物模型中，Flnc敲除導致肌肉萎縮，而Flnc過表達則促進體內肌肉肥大。我們還發現Flnc與散亂-2 (Dvl2)相互作用，激活wnt/β-catenin信號通路，并控制骨骼肌的發育。Flnc還通過降低Dvl2泛素化來拮抗lc3介導的自噬系統。此外，Flnc敲低激活并顯著增加線粒體自噬。綜上所述，這些結果表明，Flnc的缺失可誘導自噬或線粒體自噬，并調節肌肉萎縮。
本研究的轉錄組測序分析由上海派森諾生物科技有限公司完成。
原文索引： Han S, Cui C, Zhao X, Zhang Y, Zhang Y, Zhao J, Shen X, He H, Wang J, Ma M, Li D, Zhu Q, Yin H. Filamin C regulates skeletal muscle atrophy by stabilizing dishevelled-2 to inhibit autophagy and mitophagy. Mol Ther Nucleic Acids. 2021 Nov 29;27:147-164. doi: 10.1016/j.omtn.2021.11.022. PMID: 34976434; PMCID: PMC8683659.
