2022-09-06
《Journal of Hazardous Materials》
影響因子：14.224
技術手段：HPLC-MS/MS，基因組測序，RNA-seq，qRT-PCR；
東北農業大學于近期在《Journal of Hazardous Materials》上發表了一種酰胺酶和一種新型酚羥化酶催化紅球菌降解抗菌劑三氯卡班的研究成果。
三氯卡班（Triclocarban，TCC）是一種廣譜抗菌劑，由于較高的殺菌效果而被廣泛應用于藥品和個人護理產品中。因為TCC具有疏水的特性以及污水處理廠去除不完全的問題，TCC是自然環境中檢測最廣泛的污染物之一。而且由于TCC對哺乳動物、水生生物和陸生生物有毒力，長期暴露于生態系統中的TCC及其脫氯代謝物已導致健康問題。因此，人們對TCC的污染問題越來越關注。
與物理和化學技術相比，微生物降解轉化TCC具有幾個優點，包括相對較高的效率和生態友好的特點。然而，考慮到TCC的頑固性和抗菌性，對有效降解TCC的微生物種類的研究有限。到目前為止，已發現的降解TCC的細菌包括鞘氨醇單胞菌YL-JM2C，蒼白桿菌TCC-1、TCC-2、MC22和假單胞菌MC46，然而這些菌株都不能將TCC作為唯一的碳源，也沒有表現出對TCC的耐受性增加。
盡管初步研究表明細菌對TCC有良好的生物降解跡象，但真正的生物降解通路尚未得到確鑿證據的證實。因此，本研究以實驗室先前分離出的以TCC為唯一碳源生長的紅球菌BX2為研究對象，探究BX2菌株對TCC的降解能力和通路、推測并驗證功能基因，為今后TCC生物修復提供理論依據。
研究結果
使用RSM優化培養條件并進行驗證
首先，探究了溫度、pH、接種量、培養時間對TCC降解率的影響，最終確定BX2菌株的最佳培養條件為30.05℃、pH為7.05、接種量為3.42%、培養時間為5.36d。在最優培養條件下，BX2菌株在5天內細胞生長迅速增加，對10mg/L TCC的降解率達76.8%，總有機碳（TOC）的去除效率為56.5%。結果表明，BX2菌株具有較強的生物降解和礦化活性，是TCC污染環境修復的重要候選菌株。
圖1 A:不同因素對BX2菌株生物降解活性的交互作用的三維響應面圖。B:菌株BX2的生長情況和對TCC的降解、礦化情況。
BX2菌株的TCC生物降解通路
采用HPLC-MS/MS法對BX2菌株降解TCC不同時間點的樣品進行分析，結果顯示，對照組只觀察到母質TCC，未檢測到其他代謝物；處理組中除TCC外陸續鑒定出6個主要化合物。基于HPLC和HPLC-MS/MS鑒定的代謝物以及前人研究的結果提出了BX2菌株降解TCC的通路。在此通路中，TCC降解的主要步驟是酰胺鍵的水解，生成產物I（DCA）和II（4-CA），產物I沒有進一步降解。隨后，產物II被脫胺和羥基化，生成產物III（4-chlorocatechol）。產物III通過鄰位裂解進一步降解形成產物IV（3-chloro-cis-cis-muconic acid）。產物IV經過一系列氧化脫酯化反應生成產物VI（β-ketoadipic acid），然后進入三羧酸（TCA）循環。
圖2 A:TCC生物轉化產物的HPLC-MS/MS分析質譜。B:BX2菌株對TCC的降解通路。
BX2菌株的全基因組和轉錄組均顯示有降解TCC的功能基因
前人研究發現，酰胺酶TccA催化TCC水解。根據BX2菌株的基因組測序數據，鑒定出16個編碼酰化酶的基因。根據氨基酸序列對已確認的酰胺酶基因TccA（KU753911）和這16個基因進行了系統發育樹分析，其中酰胺酶基因TccA、chro-orf00841、chro-orf04781和chro-orf04940聚在一起，表明它們的功能可能類似。轉錄組結果顯示，TCC處理導致58個基因上調，53個基因下調。細胞中上調的基因促進了代謝，但下調的基因表明TCC對BX2菌株仍有毒性，細胞代謝略有下降。與對照組相比，處理組編碼苯酚羥化酶的基因chr-orf07198的表達量顯著增加（log2fold-change（T/C）為4.61）。
qRT-PCR驗證TCC降解相關功能基因
對上述4個候選基因進行qRT-PCR驗證，結果顯示，酰胺酶基因chr-orf04781和chr-orf00841在24-84h時的mRNA表達量略高于對照組，但在96h時顯著低于對照組，因此這兩個基因可能不參與TCC的降解；在24-96h時，處理組中chr-orf04940（命名為TccS）和chr-orf07198(命名為PHIND)基因的表達量顯著增加，與預期的降解通路一致，表明TccS和PHIND在BX2菌株降解TCC中起著至關重要的作用。
圖3 BX2菌株在加TCC和不加TCC情況下培養12-96h后，基因的相對表達水平。
TccS和PHIND的活性位點和底物結合口袋
為了確定上述基因編碼的TccS和PHIND的功能，本研究通過分子對接預測了相應底物與蛋白質之間的相互作用。TccS包含一個底物結合口袋。與酰胺轉移酶蛋白的序列比對顯示，TccS包含一個由Gly275-Gln400-Lys402組成的催化三聯體。此外，4-CA可以與蛋白活性位點殘基（Ser363）形成氫鍵相互作用。活性位點氨基酸殘基形成了PHIND的底物結合口袋。TCC的氫鍵供體和受體基團可以與TccS的催化三聯體Gly275-Gln400-Lys402形成氫鍵相互作用。4-CA通過氨基氫鍵固定在PHIND的活性位點上。從結構上看，TccS和PHIND可能分別具有催化TCC及其中間體4-CA降解的潛力。
圖4 A:TccS與TCC的結合方式。a:復合體的三維結構。b:活性部位的表面，TCC化合物呈現為黃色。c:復合物的詳細結合模式，蛋白質骨架呈現在管中并呈現彩虹色。B: PHIND與4-CA的結合方式。黃色短劃線表示氫鍵距離或π堆積。
TccS和PHIND的異源表達、純化及功能分析
將TccS和PHIND基因克隆到pET28a（+）中，并在大腸桿菌BL21（DE3）中表達。TccS蛋白分子量為50.411kDa，屬于酰胺酶家族。純化后的TccS蛋白60min降解52.0%的10mg/L TCC，180min降解96.4%，240min完全降解。PHIND蛋白分子質量為38.498kDa，屬于多組分單加氧酶家族。純化后的PHIND蛋白60min降解42.3%的5mg/L 4-CA，240min降解97.2%，300min完全降解。采用HPLC-MS/MS分析純PHIND產生的4-CA降解產物。檢測到母體4-CA底物和一種子產物，子產物與產物III相對應，如我們提出的TCC降解通路所示。
根據系統發育分析和序列比對，TccS與其它經鑒定的酰胺酶基因的同源性較低（27.30-42.07%）；PHIND與不同的酚羥基化酶具有較低的同源性（23.38-34.91%）（數據來自NCBI SwissProt蛋白數據庫）。
圖5 A：HPLC檢測TccS催化的TCC降解產物。B：HPLC檢測PHIND催化的4-CA降解產物。C：基于TccS（a）和PHIND（b）的氨基酸序列及其同源蛋白構建的系統發育樹。
敲除BX2菌株的TccS和PHIND基因
為了驗證TccS和PHIND在BX2菌株TCC分解代謝中的生理作用，通過同源重組構建了TccS和PHIND的缺失突變體BX2ΔtccS和BX2ΔPHIND菌株。研究了野生型BX2菌株和突變株BX2ΔtccS的TCC降解速率和生長情況，以及野生型BX2菌株和突變株BX2ΔPHIND的4-CA降解速率和生長情況。結果表明，BX2菌株中TccS參與了TCC的降解，PHIND參與了4-CA的降解，且缺失TccS和PHIND不足以完全抑制TCC和4-CA的降解，這可能與其它相關基因的存在有關。綜上所述，TccS和PHIND是BX2菌株TCC代謝的關鍵酶，即TCC通過TccS轉化為DCA和4-CA，然后PHIND將4-CA羥基化為4-氯鄰苯二酚（產物III）。
圖6 BX2ΔtccS（a）菌株降解TCC，BX2ΔPHIND（b）菌株降解4-CA。
結 論
本研究發現紅球菌BX2對TCC具有有效的降解和礦化能力。降解代謝產物分析表明，菌株BX2存在一條進入TCA循環的TCC生物降解通路。對BX2全基因組和轉錄組的挖掘發現了TCC降解相關基因。通過異源表達和基因敲除分別驗證了TccS和PHIND基因分別是TCC及其中間體4-CA轉化的必要基因。本研究為研究TCC的微生物降解機制提供了新的思路，為進一步利用微生物修復TCC污染提供了參考，并為今后酶資源的應用提供了理論依據。
本研究的基因組和轉錄組測序分析由上海派森諾生物科技有限公司完成。
參考文獻：
Li C, Sun Y, Sun G, Zang H, Sun S, Zhao X, Hou N, Li D. An amidase and a novel phenol hydroxylase catalyze the degradation of the antibacterial agent triclocarban by Rhodococcus rhodochrous. J Hazard Mater. 2022 May 15;430:128444. doi: 10.1016/j.jhazmat.2022.128444.
