《Applied Microbiology and Biotechnology》
近日，吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院在生物學(xué)領(lǐng)域的《Applied Microbiology and Biotechnology》發(fā)表新研究成果！本研究采用NaHCO3預(yù)處理固相發(fā)酵方法，通過(guò)接種從雞盲腸中分離出的可降解木質(zhì)纖維素的B. velezensis CL-4，使玉米胚芽粕（CGM）的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值最大化。對(duì)B. velezensis CL-4進(jìn)行基因組測(cè)序和代謝組測(cè)序，檢測(cè)到了與木質(zhì)纖維素降解相關(guān)的基因以及相關(guān)氨基酸。這一新的CGM預(yù)處理技術(shù)為利用B. velezensis CL-4降解木質(zhì)纖維素組分、改善CGM營(yíng)養(yǎng)特性、擴(kuò)大CGM木質(zhì)纖維素生物飼料生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。
玉米胚芽粕（CGM）是從胚芽部分提取玉米油后通過(guò)濕磨生產(chǎn)的，具有良好的營(yíng)養(yǎng)特性（中等能量和蛋白質(zhì)）。豆粕（SBM）的有效性和價(jià)格的波動(dòng)是確定動(dòng)物口糧替代和未充分利用的蛋白質(zhì)飼料成分的動(dòng)力。CGM、SBM、玉米和結(jié)晶氨基酸（aa）的組合可用于形成均衡日糧，而且CGM可用于替代豬、家禽、反芻動(dòng)物和魚(yú)類(lèi)日糧中的部分SBM。然而，CGM中的高纖維素和半纖維素含量限制了其利用，這是由于養(yǎng)分有效性和動(dòng)物生產(chǎn)性能下降。因此，需要盡量減少這些抗?fàn)I養(yǎng)因素，提高CGM的營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量，以獲得更廣泛的可接受性。
使用微生物進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵（SSF）是提高各種蛋白質(zhì)來(lái)源的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的一種很有前景的方法。在之前的研究中，固態(tài)發(fā)酵與未發(fā)酵的相比，蛋白源的營(yíng)養(yǎng)成分相同或更好。此外，許多研究報(bào)告，芽孢桿菌富含纖維素酶和半纖維素酶。之前的研究報(bào)道了Bacillus velezensis編碼豐富的木質(zhì)纖維素，從而提高了豆粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。然而，截至目前還沒(méi)有關(guān)于B. velezensis發(fā)酵CGM的報(bào)道。本研究從家禽盲腸中分離得到菌株CL-4，對(duì)其基因組進(jìn)行了測(cè)序，確定了其降解木質(zhì)纖維素的能力，并測(cè)定了菌株CL-4發(fā)酵的CGM的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值并提出一種CGM的預(yù)處理方法。
養(yǎng)殖場(chǎng)中健康雞的盲腸內(nèi)容物中分離的Bacillus strains。
Illumina Novaseq、Pacbio sequel II
細(xì)菌基因組完成圖測(cè)序、代謝組測(cè)序、16s系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建、ANI分析、比較基因組分析
03、研究結(jié)果B. velezensis CL-4的鑒定和木質(zhì)纖維素降解潛力
從健康家禽的盲腸內(nèi)容物中分離出四種纖維素菌株，包括CL-1、2、4和7。其中，只有菌株CL-4對(duì)纖維素酶、蛋白酶、α-淀粉酶、木聚糖酶和果膠酶的活性水解最大。通過(guò)16S rRNA測(cè)序、16S進(jìn)化樹(shù)分析鑒定CL-4的屬性，再根據(jù)ANI分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，B. velezensis M75和菌株CL-4之間的ANI值具有99.29%的同源性，與Bacillus amyloliquefaciens （93%)、Bacillus siamensis（94%)和Bacillus subtilis（76%)的同源性較低（圖 2）。確定菌株CL-4為B. velezensis，命名為B. velezensis CL-4。
圖1：B. velezensis CL-4的形態(tài)學(xué)特征與16S rRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析
圖2：B. velezensis CL-4與Bacillus物種的平均核苷酸一致性（ANI）分析
B. velezensis CL-4的基因組測(cè)序、組裝和功能注釋
B. velezensis CL-4的全基因組為4,063,558 bp的一條環(huán)狀染色體，GC含量為46.27%（圖3）。染色體上共有4063個(gè)蛋白質(zhì)編碼序列（CDS）。CDS分別在NR、eggNOG、KEGG、Swiss-Prot和GO中進(jìn)一步注釋?zhuān)鼈兊臄?shù)量分別為4026、3354、2194、3602和2741。值得注意的是，KEGG注釋結(jié)果中的一些代謝途徑占主導(dǎo)地位，如淀粉和蔗糖代謝（ko00500）、糖酵解/糖異生（ko00010）、氨基糖和核苷酸糖代謝（ko00520）和嘌呤代謝（ko00230）。
圖3：B. velezensis CL-4完整基因組圈圖
碳水化合物活性酶（CAZyme）注釋與比較基因組分析
基于碳水化合物活性酶（CAZy）注釋以識(shí)別參與木質(zhì)纖維素降解的基因，從CAZy家族中共鑒定出139個(gè)基因，它們分布在五個(gè)亞家族中（圖4）。B. velezensis CL-4組裝的完整基因組與從GenBank DNA數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到的其他10個(gè)B. velezensis菌株的基因組進(jìn)行了比較分析。這些菌株的糖基轉(zhuǎn)移酶（GT）和多糖裂解酶（PL）家族數(shù)目相同，而菌株CL-4含有更多的糖苷水解酶（GH）、碳水化合物酯酶（CE）和輔助活性（AA）家族成員和更少的碳水化合物結(jié)合模塊（CBM）成員。
圖4：B. velezensis CL-4碳水化合物活性酶家族的基因統(tǒng)計(jì)
碳酸氫鈉預(yù)處理后，B. velezensis CL-4細(xì)胞的數(shù)量和pH值顯著增加。碳酸氫鈉的量?jī)?yōu)化為0.06 g/mL。未經(jīng)預(yù)處理，B. velezensis CL-4的數(shù)量從6.37±0.09 log CFU/g下降到3.01±0.06 log CFU/g，并且在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，CGM保持酸性（pH 4.15±0.01）。然而，在添加碳酸氫鈉后將pH調(diào)節(jié)至中性。孵育24和48小時(shí)后，B. velezensis CL-4在24小時(shí)的密度從6.53±0.08 log CFU/g增加到9.35±0.11 log CFU/g。孵育48 h時(shí)最終計(jì)數(shù)為10.98±0.31 log CFU/g，pH從7.09±0.04（0 h）逐漸增加到7.16±0.03（24 h）和7.54±0.02（48 h）。
PCGM的CP含量為27.32±0.16%。然而，CP含量在發(fā)酵24 h后增加到28.11±0.33%，在發(fā)酵24-48 h期間進(jìn)一步達(dá)到30.58±0.07%。PCGM的TCA-SP含量在24小時(shí)內(nèi)從37.44±0.76下降到35.36±0.08%，并在24-48小時(shí)間隔內(nèi)顯著增加至45.98±0.30%。FPCGM的灰分和總磷濃度高于CGM和PCGM。在發(fā)酵過(guò)程中，半纖維素顯著減少（從17.69±0.74到5.67±0.07%）。在CGM中，預(yù)處理和48 h發(fā)酵過(guò)程中半纖維素降解率的相對(duì)率顯著降低了71.35%。此外，CGM和PCGM之間的纖維素降解沒(méi)有顯著差異，而PFCGM在發(fā)酵48小時(shí)時(shí)纖維素降解率為21.33%。值得注意的是，在發(fā)酵48小時(shí)后，接種B. velezensis CL-4顯著改變了CGM中的氨基酸譜。對(duì)于大多數(shù)aa，它們的含量在24-48小時(shí)的發(fā)酵過(guò)程中增加。相應(yīng)地，CGM、PCGM和FPCGM24h之間的aa含量沒(méi)有差異（P<0.05）。最終，與CGM和PCGM相比，48小時(shí)發(fā)酵飼料的總氨基酸含量顯著增加至20.11±0.67%。
CGM和PCGM的結(jié)構(gòu)緊湊而光滑，而FPCGM在發(fā)酵后呈碎片狀、破裂狀和多纖維素狀。
在不同的發(fā)酵時(shí)間后獲得UHPLC-Q-TOF MS總離子色譜儀（TIC）。對(duì)于每個(gè)色譜峰，響應(yīng)強(qiáng)度和保留時(shí)間基本重疊，表明由于儀器誤差導(dǎo)致的變化有限。對(duì)從所有樣品中提取的峰進(jìn)行PCA分析。在ESI +和ESI -模式下，QC樣品緊密聚集，表明重現(xiàn)性良好；因此，可以可靠地比較樣品之間的代謝物數(shù)據(jù)。
為了區(qū)分全局代謝物發(fā)酵階段之間的差異，開(kāi)發(fā)了一種無(wú)監(jiān)督PCA模型。顯示了具有主成分分析（PCA）得分圖的CGM、PCGM和FPCGM48h樣本的分類(lèi)效果。在得分圖中，橢圓代表霍特林統(tǒng)計(jì)量，置信度為95%。在這些PCA得分圖中，CGM、PCGM和FPCGM48h的樣品在簇中顯著分離，代表預(yù)處理和發(fā)酵階段。PCA和OPLS-DA均用于觀察樣本組之間的總體分類(lèi)趨勢(shì)和差異程度。R2、PCA的Q2值和正交偏最小二乘方判別分析（OPLS-DA）模型的相應(yīng)結(jié)果表明模型的有效性令人滿意，表明原始模型具有較高的可靠性和強(qiáng)大的預(yù)測(cè)能力。
在代謝組學(xué)中，嚴(yán)格的OPLS-DA VIP >1和P值<0.05被用作具有顯著差異的代謝物的篩選標(biāo)準(zhǔn)。與PCGM相比，CGM和FPCGM的關(guān)鍵代謝物的總顯著差異分別為37和43。顯示了具有ESI陽(yáng)性和陰性代謝物模式的顯著差異代謝物的鑒定。
用碳酸氫鈉處理CGM后，2-氧代己二酸和二甲基砜顯著增加。在PCGM和FPCGM的發(fā)酵過(guò)程中，蔗糖、麥芽三糖、棕櫚酸、16-羥基棕櫚酸、亞油酸和幾種二肽的濃度得到了富集，而腺苷、胞苷、鳥(niǎo)苷、S-methyl-5'-thioadenosine和腺嘌減少。此外，在PCGM發(fā)酵過(guò)程中檢測(cè)并消耗了D-山梨糖醇、D-蘇糖醇和α-D葡萄糖。在本研究中，差異豐度評(píng)分的所有富集代謝途徑中蛋白質(zhì)消化吸收、碳水化合物消化吸收和氨基酸生物合成均發(fā)生上調(diào)。
本研究對(duì)雞盲腸內(nèi)容物種新分離的B. velezensis CL-4的基因組進(jìn)行了測(cè)序分析，比較了CGM和發(fā)酵CGM的微生物、代謝物和化學(xué)變化。研究表明，使用B. velezensis CL-4可以降解木質(zhì)纖維素成分、改善CGM的營(yíng)養(yǎng)特性并為擴(kuò)大CGM木質(zhì)纖維素生物飼料生產(chǎn)提供了理論證明。
本研究的de novo測(cè)序與分析由上海派森諾生物科技有限公司完成。
文章索引：Chen, L., Chen, W., Zheng, B. et al. Fermentation of NaHCO3-treated corn germ meal by Bacillus velezensis CL-4 promotes lignocellulose degradation and nutrient utilization. Appl Microbiol Biotechnol (2022). https://doi.org/10.1007/s00253-022-12130-7.
