2022-08-30
《Chemosphere》 影響因子：8.943
文章題目：Prolonged exposure of azocyclotin induced inter- and transgenerational endocrine disruption on Danio rerio linked to transcriptomic and DNA methylomic alterations 技術手段：RNA-seq; WGB-seq 浙江大學在《Chemosphere》上發表了三唑錫暴露誘導斑馬魚代際和跨代內分泌紊亂與轉錄組和DNA甲基化改變有關的研究成果。
研究背景
環境污染物對生態(毒素)相關物種的表觀遺傳分析的代際效應評估被認為是一種潛在的未來風險評估工具。三唑錫（ACT）是國內廣泛使用的一種有機錫殺螨劑，可對直接暴露的環境生物產生內分泌干擾作用，但它是否會產生跨代負面影響仍不得而知。因此本研究以斑馬魚為實驗對象，探究了低劑量三唑錫對暴露F0代和未暴露后代(F1和F2)發育和生殖內分泌的干擾作用以及與表觀遺傳變化之間的潛在關聯。
技術路線
研究內容
三唑錫在暴露溶液和斑馬魚中的定量 在暴露溶液中，ACT在一個更新周期內的降解率小于20% (表1)，符合OECD (1984)指標。在空白對照VC以及0.18、0.24和0.36 μg/L三唑錫暴露結束時，斑馬魚ACT測定值均低于LOD，分別為47.84±10.91、51.34±8.06和82.16±7.97 μg/kg。0.36 μg/L ACT組F0代F1胚胎未檢出ACT。 表1 一個更新周期內暴露溶液中的ACT濃度 F0成年斑馬魚的發育和生殖毒性 暴露結束時（180 dpf）， VC（對照組）斑馬魚的呼吸阻力為76.1±1.7%，與ACT各暴露組(0.18、0.24、0.36 μg/L組分別為75.0±1.7%、75.6±2.1%、74.4±2.6%)無顯著差異(p > 0.05)。也測定了雌斑馬魚的全身長度（WBL）、體重（BW）、性腺指數（GSI，即性腺濕重/體重× 100%）、肝體指數（HSI，即肝臟濕重/體重× 100%）和產蛋量（EP）等發育和生殖毒理學指標。結果表明，ACT僅在0.36 μg/ L暴露組對上述毒理指標有影響。其中0.36 μg/L ACT可顯著抑制雄性和雌性的WBL、BW和GSI（圖1A-C）。HSI只有雌性與對照相比顯著降低（圖1D）。此外，0.36 μg/L的ACT會抑制雌性的繁殖能力，每只雌鼠的EP減少了21.8%（圖1E）。與VC相比，晚期卵母細胞（LO）和早期卵黃卵母細胞（EVO）的比例顯著降低，皮質肺泡卵母細胞（CAO）和初級卵母細胞（PO）顯著增加。在睪丸中，與VC相比，精子（Sz）顯著降低，精母細胞（Sc）顯著升高，精原細胞（Sg）的比值無顯著變化。 圖1 ACT誘導F0成年斑馬魚發育和生殖毒性作用 未暴露后代的跨代發育和生殖毒性 對未暴露后代的胚胎毒性 用0.36 μg/L ACT (2 hpf ~ 180 dpf)對F0斑馬魚未直接暴露后代進行了胚胎毒性終點受精率（FR）、心搏（HB）、孵化率（HR）、自發運動頻率（SMF）、畸形率（MR）和成活率（SR）的測定。結果表明，0.36 μg/L組較VC組F1和F2的FRs、HR、HB和SMF均顯著降低 (圖2A-D)。且0.24和0.36 μg/L ACT處理F0斑馬魚子代出現形態缺陷（圖2E）。 對成年后代的發育和生殖毒性 F1和F2的發育和生殖毒性效應與接觸ACT的F0成年鼠相似。一般情況下，0.18或0.24 μg/L ACT對F0斑馬魚成年子代無明顯毒性作用，0.36 μg/L ACT僅對F0斑馬魚的子代有毒性作用。F0處理0.36 μg/L ACT后，F1代和F2代的雌性與雄性BW、WBL、HIS、GSI以及EP(僅雌性)均被顯著抑制（圖2F-J）。此外，F0斑馬魚暴露于0.36 μg/L ACT后，F1和F2成年斑馬魚的CAO(卵巢中)和Sc(睪丸中)比例顯著增加，LO(卵巢中)和Sz(睪丸中)比例顯著降低(圖2K,L)。 圖2 斑馬魚子代胚胎毒性(A-E)和成年子代發育和生殖毒性(F-L) F0及其子代成年斑馬魚血漿中性激素的變化 將F0斑馬魚暴露于不同濃度的ACT 180 d后，測定F0、F1、F2成年斑馬魚血漿中性激素雌二醇（E2）和睪酮（T）的水平。結果顯示，0.18和0.24 μg/L ACT處理對F0、F1和F2成魚的E2和T沒有明顯影響。0.36 μg/L ACT組F0成蟲及其子代成蟲E2和T變化顯著，但呈相反變化。對于F0, 0.36 μg/L ACT處理后雌性和雄性斑馬魚E2濃度分別降低了35.0% 和47.8%（圖3A），而T分別增加了102.0% 和8.8%（圖3B）。在后代中，E2和T在F1和F2中的變化非常接近：當F0濃度為0.36 μg/L ACT時，F1代雌性和雄性的E2濃度分別降低52.3% 和49.8%，F2代雌性和雄性的E2濃度分別降低48.3% 和46.1%（圖3C）。隨著E2的降低，F1雌、雄T分別增加44.3% 和22.6%，F2雌、雄T分別增加36.7% 和17.0%（圖3D）。以上結果表明，0.36 μg/L ACT可抑制F0和后代體內E2的合成，促進T的含量，對斑馬魚性激素產生跨代干擾作用。 圖3 ACT暴露對F0斑馬魚成體及其成年子代血漿中性激素含量的影響 全基因組甲基化水平 研究測定了成年斑馬魚(F0、F1、F2代)生殖腺及胚胎(F1、F2代)中5-mC含量。VC組F0、F1和F2 3代成蟲5-mC含量差異不顯著。0.18和0.24 μg/L ACT處理對F0成蟲及其子代DNA甲基化無顯著影響，但0.36 μg/L ACT處理對F0及其子代DNA甲基化有顯著影響，且對雌性的DNA甲基化作用強于雄性（圖4A）。0.36 μg/L ACT處理下，F0、F1和F2雌性5-mC含量分別降低了38.6%、18.8% 和20.4%，雄性5-mC含量分別降低了10.2%、9.9%和13.4%（圖4B）。對于受精后5d的F1和F2胚胎，只有0.36 μg/L ACT- F0處理的胚胎5- mc含量存在顯著差異，其中F1和F2的5- mc含量分別降低了38.0% 和11.1%。這些結果表明，斑馬魚DNA甲基化在F1代發生強烈，而在F2代減弱。 圖4 ACT對暴露的F0成年斑馬魚和未暴露后代(胚胎和成魚) DNA甲基化水平的影響 未暴露后代的全基因組基因表達譜 RNA-seq組裝和差異表達基因圖譜 利用從F1和F2胚胎分離到的RNA進行RNA-Seq分析。與VC相比，F1胚胎中發現了16362個DEGs，共25755個基因中上調9031個，下調7061個；F2胚中發現了15511個DEGs，共25772個基因中有8947個上調，6564個下調。在兩代間共發現13662個重疊差異表達基因（圖5E）。 GO和KEGG通路分析 GO分析結果顯示，F1和F2代GO數據庫中分別有317和277個條目著富集（FDR <0.05），其中F1中有206、64和47個條目，F2中有175、53和49個條目分別屬于生物過程、細胞成分和分子功能三大類。此外，兩代之間還發現了203個重疊條目（圖5F）。圖5 A、B顯示了兩代斑馬魚的GO富集前20條目（基于最小FDR值）。KEGG分析顯示，F1和F2代各代的DEGs分別在5條和7條信號通路上顯著富集（FDR<0.05）（圖5 C、D），此外，兩代之間還存在3條重疊通路(圖5G)，即嘧啶代謝通路、ECM受體相互作用通路和剪接體通路。 圖5 F1和F2代斑馬魚中GO和KEGG富集通路圖 未暴露斑馬魚后代的全基因組DNA甲基化圖譜 由于基因序列區域的胞嘧啶甲基化在調節生理功能中起著重要作用，因此本文主要研究基因序列區域（啟動子區域和基因體區域）的胞嘧啶甲基化（CpG型）。根據啟動子區域的差異甲基化的胞嘧啶（DMC），在0.36 μg/L-ACT組的F1和F2代的26151個基因中，分別有3891個（3681個低甲基化和210個高甲基化）和2601個（2213個低甲基化和389個高甲基化）DMGs。圖6A-D展示了F1和F2代前10個顯著富集GO條目和前20條KEGG代謝通路繪制的氣泡圖。當DMC在基因體區域計數時，在F1代和F2代的26151個基因中，分別發現了17107個（16974個低甲基化和132個高甲基化）和10694個（10456個低甲基化和238個高甲基化）DMGs。F1代和F2代共有9687個DMGs重疊。共鑒定出367個重疊的GO條目以及19個重疊的代謝通路。圖6E-H展示了F1和F2代前10個顯著富集GO條目和前20條KEGG代謝通路繪制的氣泡圖。綜上所述，0.36μg/L-ACT處理組F0的斑馬魚后代中，來自最初的WGB-Seq數據的一般胞嘧啶檢測和全基因組基因偏向于低甲基化，這與上述整體DNA甲基化水平檢測結果一致。 RNA-seq與WGB-seq相關性分析 研究發現，全基因組DNA的整體低甲基化導致了全基因組基因表達的整體上調。基于啟動子區域的DMC，F1和F2中分別有2506和1596個DMGs與DEGs相關。當DMC在基因體區進行計數時，F1和F2中與DEG相關的DMG數量分別為10998和6649個。在這些與DEGs相關的DMGs中，無論DMGs是根據啟動子區DMC還是基因體區DMC計算，低甲基化和表達上調的基因都是占大多數。 此外，作者還對與DEGs相關的DMGs進行了KEGG富集分析。利用DMC在啟動子區域計數的DMGs，在F1代和F2代之間有一個途徑(ECM-受體相互作用)重疊。利用DMC在基因體區域計算的DMGs，發現兩代斑馬魚之間存在10個重疊通路(包括ECM受體相互作用、心肌細胞腎上腺素能信號通路、尿代謝、鈣信號通路、細胞粘附分子、apelin信號通路、心肌收縮、細胞因子-細胞因子受體相互作用、血管平滑肌收縮和病灶粘附)。 圖6 基于DMGs前10個條目做GO和KEGG富集分析
研究結論
從受精卵到性成熟暴露于0.36 μg/L ACT不僅會導致直接暴露的親代斑馬魚的發育和生殖毒性，還會對非直接暴露的F1和F2后代產生甲狀腺和性腺內分泌干擾，表現出代際和跨代效應。代際和跨代效應可能與轉錄組和DNA甲基化有關。然而，ACT對斑馬魚的跨代效應的分子機制有待進一步研究。
本研究的DNA甲基化測序工作由上海派森諾生物科技有限公司完成。
原文索引：
Jiao F, Ma Y, Hu T, Qiao K, Jiang Y, Zhu W, Jin Q, Gui W. Prolonged exposure of azocyclotin induced inter- and transgenerational endocrine disruption on Danio rerio linked to transcriptomic and DNA methylomic alterations. Chemosphere. 2022 Sep;302:134847.doi:10.1016/j.chemosphere.2022.134847. Epub 2022 May 5. PMID: 35526687.
