2022-08-23
《The Journal of Clinical Investigation》
影響因子：19.456
文章題目：Upregulated YB-1 protein promotes glioblastoma growth through a YB-1/CCT4/mLST8/mTOR pathway
技術手段：RNA-Seq、定量蛋白質組學
派森諾生物與中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所攜手合作，在《The Journal of Clinical Investigation》上發表了YB-1蛋白上調后可通過YB-1/CCT4/mLST8/mTOR通路促進膠質母細胞瘤生長的研究成果。
Part 01
研究背景
膠質瘤是成人最常見的原發性腦腫瘤，膠質母細胞瘤約占惡性膠質瘤的60%-70%。大多數膠質母細胞瘤患者接受治療后的5年生存率為5.1%，中位生存期為15-23個月。因此，更好地了解觸發膠質母細胞瘤形成的關鍵分子和途徑，有助于識別早期診斷和有效治療膠質母細胞瘤的新靶點。
人類Y-box結合蛋白1 (YB-1)在生理和病理條件下參與多種細胞過程。YB-1被認為參與了幾乎所有的RNA相關過程。最近的研究表明，膠質瘤中YB-1的高表達與細胞增殖、生存、遷移和對替莫唑胺的耐藥性相關，并提示YB-1可能是膠質瘤進展的潛在生物標志物。然而，YB-1在膠質母細胞瘤中的分子功能和調控機制尚不清楚。
Part 02
技術路線
Part 03
研究結果
1、膠質母細胞瘤組織YB-1蛋白顯著升高
YB-1蛋白在正常神經膠質中低表達，在膠質母細胞瘤中顯著上調(圖1A)。而YB-1 mRNA水平在膠質母細胞瘤與相鄰組織間變化不明顯(圖1B)。此外，原發性膠質母細胞瘤患者中YB-1蛋白的高表達預示預后不良(圖1D)。
圖1. YB-1蛋白在膠質母細胞瘤中顯著上調，預示預后不良
2、膠質母細胞瘤細胞中YB-1的減少可抑制mTOR信號傳導
U251和U87細胞敲低YB-1后導致細胞增殖和侵襲減少。YB-1敲低后分別有227和208個基因上調，550和199個基因下調。GO分析顯示YB -1調控的基因在神經系統發育、神經發生、神經元分化、受體配體活性和細胞外基質組織等富集。定量蛋白質組學分析顯示YB-1敲低后，分別有2和45個蛋白上調，213和467個蛋白下調。下調的蛋白在鈣粘蛋白結合、翻譯、核糖體組裝、RNA加工、粘著斑富集(圖2A, B)。我們發現多數在mRNA水平上變化不大的基因反而在蛋白水平上表達下降(圖2C, D)，表明YB-1在翻譯水平上促進了大量基因的表達。此外，mTORC1和mTORC2的標記物在YB-1敲低的U251和U87細胞中均顯著降低(圖3A, B)。
圖2.膠質母細胞瘤細胞中YB-1缺失后轉錄組和蛋白質組學分析
3、YB-1通過mLST8激活mTORC1和mTORC2信號
敲低YB-1后，mTOR復合物的mLST8被抑制(圖3C，D)，mLST8的異位表達挽救了mTORC1和mTORC2減弱的信號活性(圖3E, F)。但YB-1不影響mLST8的mRNA水平(圖3G)，表明YB-1在轉錄后控制mLST8的表達。隨后發現敲低YB-1導致mLST8的降解速度更快(圖3H, I)，表明YB-1通過穩定mLST8蛋白以上調mTORC1和mTORC2信號。
圖3.YB-1通過穩定mLST8激活mTORC1和mTORC2信號
4、YB-1通過增加CCT4 mRNA翻譯來穩定mLST8蛋白
我們發現mLST8和CCT組分之間存在相互作用(圖4 A, B, C)。敲低YB-1后，CCT4被顯著抑制(圖4D)。敲低CCT4后，mLST8蛋白表達被抑制(圖4E, F)。用溶酶體抑制劑處理CCT4敲低細胞可降低mLST8蛋白被抑制水平，說明CCT4對mLST8具有保護作用(圖4G, H)。此外，異位表達CCT4可提高mTORC1和mTORC2被抑制的信號活性(圖4I, J)，這表明YB-1通過CCT4/mLST8級聯上調mTOR信號通路。
圖4.YB-1通過CCT4促進mLST8折疊
5、YB-1促進CCT4 以及自身mRNA的翻譯
CLIP-RT-qPCR分析證實YB-1與CCT4 5'UTR結合(圖5D)。突變該結合位點后，CCT4 5'UTR突變報告基因對YB-1過表達不再敏感(圖5E)。我們發現過表達YB-1可以增強細胞內源性YB-1的表達(圖5E, F)。我們隨后確定了YB-1 mRNA 5 ' UTR中的幾個YB-1結合位點(圖5H, I)。綜上所述，YB-1通過結合自身mRNA和CCT4 mRNA的5 ' UTR，從而激活自身mRNA和CCT4 mRNA的翻譯。
圖5.YB-1調控CCT4及其自身mRNA的翻譯
6、YB-1通過CCT4/mLST8級聯維持膠質母細胞瘤細胞的自我更新
在YB-1敲低的細胞中重新引入CCT4或mLST8表達，可以激活mTOR信號(圖6A, B)，并部分拯救細胞增殖、腫瘤球形成和GSC自我更新(圖6,C-H)。
圖6.GSCs的細胞增殖和自我更新需要YB-1/CCT4/mLST8軸
7、YB-1/CCT4/mLST8/mTOR軸在體內促進膠質母細胞瘤的生長
YB-1敲低細胞形成的腫瘤更小(圖7A-C)。導入CCT4或mLST8后部分挽救了體內腫瘤細胞的生長以及mTOR信號的瘤內活性(圖7 A-D)。注射YB-1敲低細胞的小鼠存活時間最長，而增加CCT4或mLST8的表達可縮短小鼠的存活時間(圖7E)。
圖7.YB-1/CCT4/mLST8軸在體內促進腫瘤生長
8、YB-1/CCT4/mLST8/mTOR通路在膠質母細胞瘤中表達上調
膠質母細胞瘤組織中CCT4和mLST8表達上調(圖8A)。YB-1、CCT4、mLST8表達水平相互正相關(圖8C-E)，并且與激活S6K1信號呈正相關(圖8F-H)。與YB-1類似， CCT4、mLST8和激活的S6K1高水平表達預示著較差的生存率(圖8I-K)。
圖8.YB-1/CCT4/mLST8/mTOR通路在膠質母細胞瘤中表達上調
9、特異結合YB-1的誘餌寡核苷酸在體內抑制膠質母細胞瘤的生長
含CAUC序列的RNA誘餌探針可阻斷YB-1的RNA結合活性(圖9A,B)，在細胞中引入攜帶2份CAUC拷貝的YB-1特異性RNA誘餌可以抑制mTORC信號(圖9E-G)。YB-1 RNA誘餌可抑制細胞的增殖和自我更新(圖9H, I)。我們發現植入YB-1 RNA誘餌轉染細胞的小鼠，其腫瘤生長較慢并且生存率提高(圖9J-M)。
圖9.靶向YB-1的RNA誘餌寡核苷酸在體內抑制腫瘤細胞生長
Part 04
結 論
在本研究中，我們發現YB-1蛋白在膠質母細胞瘤中顯著過表達，并作為mTORC1和mTORC2信號的關鍵激活因子。在機制上，YB-1結合CCT4 mRNA的5'UTR，促進CCT4的翻譯，進而通過促進mLST8折疊激活mTOR信號通路。此外，YB-1通過與其5'UTR結合來調節自身的翻譯，導致mTOR信號的持續激活。特異靶向YB-1的RNA誘餌可以減緩小鼠腫瘤生長和提高生存率。這些發現揭示YB-1/CCT4/mLST8/mTOR通路在促進膠質母細胞瘤生長中的作用，提示YB-1是治療膠質母細胞瘤的潛在治療靶點。
本研究的轉錄組測序、數據分析工作由上海派森諾生物科技有限公司完成。
原文索引：
Wang JZ, Zhu H, You P, Liu H, Wang WK, Fan X, Yang Y, Xu K, Zhu Y, Li Q, Wu P, Peng C, Wong CC, Li K, Shi Y, Zhang N, Wang X, Zeng R, Huang Y, Yang L, Wang Z, Hui J. Upregulated YB-1 protein promotes glioblastoma growth through a YB-1/CCT4/mLST8/mTOR pathway. J Clin Invest. 2022 Apr 15;132(8):e146536. doi: 10.1172/JCI146536.
