2022-08-16
影響因子：5.058
派森諾與沈陽醫學院攜手合作，在國際著名雜志《Frontiers in Medicine》發表了EPN3抑制乙肝病毒復制的調控機制。
技術路線
研究背景
乙肝是病毒性肝炎主要類型之一，具有傳染性，在全世界范圍內都有病例，病毒性肝炎不斷加重會導致肝硬化，并逐漸發展為肝癌。目前絕大多數慢性乙肝需要抗病毒治療，只能控制病毒復制，達到臨床治愈，但是并不能徹底治愈，因此本研究從轉錄組角度對EPN3抑制乙肝病毒復制的作用機制進行了探討。
研究材料與方法
Huh7 和 HepG2細胞
2.測序平臺
Illumina Hiseq 2500
3.分析方法
轉錄組測序，熒光素酶檢測，qPCR，WB，ELISA等。
研究結果
將空質粒和HBV pPB分別導入到Huh7細胞，通過RNA-seq分析發現了13個上調基因和29個下調基因，進一步針對上調基因TOP 5(EPN3、SEMA5B、UBD、KLRF1、TAS2R38)和下調基因TOP 2(SLC25A22、LPA)構建siRNA載體，與pPB一起導入Huh7細胞。結果顯示，siEPN3轉染組的HBV RNA表達水平顯著高于siRNA陰性對照(siNC)轉染組(圖2A)而其他siRNAs并不影響病毒RNA復制。研究又經過一系列實驗(圖2B-J，圖3)，結果都表明EPN3對HBV RNA具有負調控作用。
圖1差異表達基因火山圖(A)和熱圖(B)
圖2 EPN3負調控HBV RNA表達
圖3 小鼠乙肝模型體內注射實驗
2.EPN3以轉錄偶聯方式抑制HBV RNA
本研究為了進一步闡明EPN3負調控HBV RNA表達的分子機制，用轉錄抑制劑ActD處理空載體和EPN3轉染的Huh7細胞，結果發現ActD減少了空載體中的病毒RNA，但沒有減少pEPN3轉染體中的病毒RNA(圖4)。研究推測EPN3抑制病毒RNA，依賴于轉錄過程。然后進一步驗證了EPN3介導的HBV RNA還原所必需的epsilon莖環結構，構建突變型pCMV1.2xHBVNL載體，其5’和3’epsilon結構缺失，當pCMV1.2xHBVNL載體與AID載體共轉染Huh7細胞時，缺乏莖環結構的轉染體NL活性降低(圖5)。這些結果表明其EPN3抗病毒機制與AID截然不同。
圖4 EPN3負調控HBV依賴于轉錄
圖5 EPN3不需要epsilon結構來抑制HBV
3.EPN3抑制P53和IFN-α下游的乙肝病毒復制
有研究表明p53能促進EPN3表達，所以本研究推測EPN3是p53介導抗HBV下游的效應因子。實驗構建GFP-P53過表達載體，轉染后發現EPN3表達增加，而HBV相對減少(圖6A)。此外，當GFP-p53和siEPN3共轉染時，GFP-p53對HBV RNA還原作用被siEPN3減弱(圖6B)，這表明EPN3介導了P53抗HBV活性。前人研究表明IFN-α可抑制乙肝病毒的復制，研究又進一步驗證了該結果，siEPN3抑制了IFN-α對HBV RNA的還原(圖6C,D)。綜上所述，這些結果都表明EPN3負調控IFN-α/P53途徑下游的HBV RNA復制。
圖6 EPN3抑制IFN-α/p53下游的乙肝病毒復制
討 論
EPN3的抗病毒活性不需要epsilon結構，這表明它與AID作用機制是不同的。EPN3負調控HBV RNA的確切分子機制有待確定，其是否影響病毒啟動子活性或病毒RNA穩定性也是未知的。其次，HBV感染對EPN3蛋白的上調也有待驗證。綜上所述，本研究發現了一種新的宿主因子EPN3，它負調控IFN-α/p53途徑下游HBV RNA表達,但是需要進一步的研究來闡明IFN-α的詳細分子機制，為治療HBV提供一種更有效、副作用更小的方案。
本研究的測序和數據分析工作由上海派森諾生物科技有限公司完成。
原文索引：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmed.2022.944489/full
