2022-08-15
《LWT》
影響因子：6.056
近日，派森諾生物與暨南大學合作，在生物學領(lǐng)域的《LWT》發(fā)表新研究成果！本研究為了解氣單胞菌對抗生素的耐藥性及多粘菌素B的耐藥機制，分別從中國廣東七個集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖場的看似健康的汪刺魚、雜交鱧和伴生水中分離得到出6種氣單胞菌。研究結(jié)果表明，集約化養(yǎng)殖場中的汪刺魚、雜交鱧及相關(guān)環(huán)境是耐藥氣單胞菌的蓄水池，可能污染相關(guān)魚類產(chǎn)品并通過食物鏈傳播給人類，構(gòu)成潛在的公共衛(wèi)生風險。
一、研究背景
氣單胞菌屬的成員普遍存在于水環(huán)境中，總共包括36個不同的物種，其中許多長期以來一直被認為是重要的魚類病原體。氣單胞菌是一種新出現(xiàn)的人類病原體，可引起多種腸道和腸外疾病。氣單胞菌在海產(chǎn)品中的流行率很高，因此是造成海產(chǎn)品污染的主要原因。集約化養(yǎng)魚業(yè)的擴大增加了在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用抗生素治療細菌感染，這導致了水生細菌物種的抗生素耐藥性。許多產(chǎn)自各種魚類的氣單胞菌對多種抗生素產(chǎn)生了高水平的耐藥性，該病不僅會給養(yǎng)魚場造成重大經(jīng)濟損失，而且有可能通過直接或間接接觸傳播給人類，從而成為人類健康的一大擔憂。
多粘菌素脂肽類多粘菌素B是一種最后的抗生素，用于臨床治療由多藥(MDR)和廣泛耐藥細菌引起的嚴重感染，水環(huán)境被認為是多粘菌素B抗藥性細菌傳播的宿主。近年來，無論是在臨床樣本中還是在各種其他來源的分離株中，對多粘菌素B具有耐藥性的氣單胞菌的報告都有所增加。然而，氣單胞菌對多粘菌素B耐藥的機制，特別是來自水生環(huán)境的氣單胞菌的耐藥機制尚不清楚。本研究從我國集約化養(yǎng)殖環(huán)境中分離到氣單胞菌，為了解多粘菌素B對公眾健康的影響，通過對廣東省池塘水中分離到的多粘菌素B的耐藥性水平進行了評估，并對其耐藥機制進行了初步探討。
二、研究材料與方法
1.實驗材料：
從廣東省佛山市A-G池的7個池塘共采集了370個樣品，其中包括150個看似健康的汪刺魚、150個看似健康的雜交鱧和70個水樣，共分離出200株（6種類型）的氣單胞菌。
2.測序平臺
Illumina Novaseq
3.分析內(nèi)容：
細菌框架圖測序、 mcr基因鑒定、進化樹構(gòu)建、基因的遺傳環(huán)境構(gòu)建、藥敏實驗等。
三、研究結(jié)果
3.1 氣單胞菌的鑒定
本研究共分離得到200株氣單胞菌，共6種類型的氣單胞菌，包括韋氏氣單胞菌139株、嗜水氣單胞菌18株、簡大氣單胞菌18株、溫和氣單胞菌18株、豚鼠氣單胞菌18株、達克氣單胞菌1株。其中從汪刺魚體表分離到88株，從雜交鱧表面分離到83株(66株來自魚體表面，15株來自鰓，2株來自肝臟)，29株來自水樣。氣單胞菌的分離率在不同池塘水樣中汪刺魚、雜交鱧、水樣的含量分別在30.0%~80.0%、13.3%~90.0%、20.0%~70.0%之間。兩種魚在池塘C的分離率最高，在池塘A最低。
3.2 藥敏實驗
所有氣單胞菌均對至少一種抗菌劑耐藥。分離株對氨芐西林的耐藥率最高(99.0%)，對四環(huán)素(49.0%)和新諾明(43.0%)的耐藥率相對較低；頭孢硫呋喃、亞胺培南、阿莫西林-克拉維酸的耐藥率在0.5%~34.5%之間；所有分離株對呋喃妥因的敏感性均降低。在這些分離株中，52.0%被認為是多藥耐藥。耐藥率以F池最高(92.3%)，B池最低(16.1%)。最常見的MDR圖譜是Amis-CHL-FQS-PENS-SXT-Tet和FQS-PENS-SXT-Tet(n=11，5.5%)。其中1株A. veronii菌株和1株A. hydrophila分別對PENS-SXT-CEP-IMI-AMIS-FQS-CHL、AMIS-CEPS-CHL-POL-PENS-SXT-Tet等7類抗生素具有共同抗性。包括3個 A. hydrophila、3個 A. jandaei和2個A. veronii菌株在內(nèi)的7個菌株對多粘菌素B具有抗藥性；3株A. jandaei對多粘菌素B的敏感性降低，MIC值分別為128 mg/L、256 mg/L和512 mg/L，3株 A. hydrophila對多粘菌素B的MIC值為4 mg/L，2株 A. veronii對多粘菌素B的MIC值分別為4 mg/L和8 mg/L。
表1 藥敏實驗結(jié)果
圖1 200株氣單胞菌的多藥耐藥率
3.3 多粘菌素B抗性決定因素
本研究只鑒定出一個mcr-3.27基因，該基因是在A. hydrophila AC2019A10中發(fā)現(xiàn)的，與一株非親緣關(guān)系的A. hydrophila 的mcr-3.27基因有100.0%的核苷酸序列同源性。然而，在所有抗多粘菌素B的A.jandaei、A.veronii和A. hydrophila 的染色體上都發(fā)現(xiàn)了幾個mcr-3-like基因和mcr-7-like基因。Blast比對顯示所有鑒定的基因都屬于氣單胞菌的磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶，這些基因與mcr-3.1，氨基酸同源性為68.0%-79.7%。然而，它們確實與報道的EptAv3有更高的同源性(81.3%-99.1%的同源性）和EptAv7(77.5%-98.7%的同源性)，而這些基因已被證實具有多粘菌素B抗性。
3.4 mcr-3-like基因
序列分析在三株A. jandaei、兩株 A. hydrophila和一株 A. veronii中共鑒定出6個mcr-3-like基因。進一步的分析表明，三個 A. jandaei分離株的mcr-3類基因大小相同，編碼538個氨基酸的蛋白質(zhì)，而一個A. veronii 和兩個A. hydrophila的mcr-3基因大小相同，編碼541個氨基酸的蛋白質(zhì)。三個A. jandaei分離株的mcr-3基因與EptAv3的氨基酸同源性(97.8%-99.1%)高于A. veronii和A. hydrophila的同源性(81.3%-83.0%)。多粘菌素B的MIC值分別高達128 mg/L、512 mg/L和256 mg/L。在4~8 mg/L濃度范圍內(nèi)，A. veronii和A. hydrophila的MIC值明顯較低。
已鑒定的6個mcr-3-like基因與mcr-3.1和mcr-3相關(guān)的EptAv3的氨基酸序列的無根系統(tǒng)進化樹表明，三個 A. jandaei的氨基酸序列與EptAv3聚在一起。與EptAv3相比， A. jandaei分離株AC2019A5、AC2019A25和AC2019A46共有7、13和14個氨基酸替換，其中 A. hydrophila 分離株AC2019A8、AC2019A10和A.veronii分離株AC2019A24有更多的氨基酸替換。因此，這六個分離株中的mcr-3-like基因代表了六個新的mcr-3突變體。
圖2 mcr -3-like蛋白序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析
3.5 mcr-7-like 基因
序列分析在三株A. jandaei、兩株 A. hydrophila和一株 A. veronii中發(fā)現(xiàn)了7個mcr-7-like的基因。進一步的分析表明，所有氣單胞菌的mcr-7-like基因大小相同，均為1617bp，編碼538個氨基酸的蛋白質(zhì)。3個A. jandaei分離株的mcr-7基因與EptAv7的氨基酸同源性(97.8%-98.7%)高于 A. hydrophila和 A. veronii分離株(81.3%-83.0%)。已鑒定的7個mcr-7-like與mcr-7.1和mcr-7相關(guān)的EptAv7的氨基酸序列的無根系統(tǒng)進化樹，表明三個A. jandaei分離物的氨基酸序列與EptAv7聚在一起。與EptAv7相比，A. jandaei分離株AC2019A5、AC2019A25和AC2019A46的mcr-7-like基因的氨基酸共有10、12和11個氨基酸替換，其中A. hydrophila 分離株AC2019A8、AC2019A10以及A. veronii分離株AC2019A17和AC2019A24的替換更多。因此，這七個分離株中的mcr-7-like基因代表了七個新的mcr-7變體。
圖3 mcr -7-like蛋白序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析
3.6 mcr-3-like和mcr-7-like基因的功能
與只含pET-19b的E.coli BL21(DE3)相比，攜帶1626 bp mcr- 3-like基因和1617 bp mcr-7-like基因重組質(zhì)粒的A. hydrophila和A. veronii的多粘菌素B的MIC值沒有變化。而從3株A . jandaei分離株中獲得的攜帶mcr-3樣基因和mcr-7樣基因的轉(zhuǎn)化子，其多粘菌素B的MIC值為32-64 mg/L，比含空載體的E.coli BL21 (DE3) (0.5 mg/L)提高了64-128倍。這些結(jié)果表明，與eptAv3和EptAv7相比，突變較少的mcr-3類基因和mcr-7類基因?qū)е铝巳齻€多粘菌素B抗性菌株對多粘菌素B的高抗性。
3.7 mcr-3-like和mcr-7-like基因的遺傳背景
對攜帶mcr-3.27、mcr-3-like和mcr-7-like基因的contigs進行分析，探討其遺傳背景。所有氣單胞菌的mcr-3-like基因和mcr-7-like基因都被假設(shè)的和功能的蛋白質(zhì)編碼基因包圍，在側(cè)翼區(qū)域沒有發(fā)現(xiàn)可移動的遺傳元件。這些遺傳背景與A. jandaei分離株中發(fā)現(xiàn)的eptAv3和eptAv7基因相似，也與氣單胞菌等幾個菌株的相應區(qū)域相似。此外，AC2019A10中mcr-3.27基因與氣單胞菌的mcr-3-like基因和IS3基因連接，與氣單胞菌染色體上相應區(qū)域的核苷酸和氨基酸序列同源性為100.0%。
圖4 mcr或EPTA的菌株遺傳環(huán)境的比較
四、結(jié) 論
從表面健康的汪刺魚、雜交鱧及其伴生水體中分離到多種致病性氣單胞菌，所有分離株至少對一種抗生素耐藥，其中一半以上為多藥耐藥株。在7個菌株中發(fā)現(xiàn)了多粘菌素B的抗性，這是由新的染色體攜帶的mcr-3-like和mcr-7-like基因介導的。這項工作證實了集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖場中的汪刺魚、雜交鱧和伴生水體是耐藥致病性氣單胞菌的儲存庫，并在氣單胞菌中鑒定了多種與多粘菌素B抗性相關(guān)的mcr-3-like和mcr-7-like基因。需要進一步監(jiān)測水環(huán)境中氣單胞菌對抗生素的耐藥性，特別是多粘菌素B的耐藥性。
本研究的denovo測序和部分數(shù)據(jù)分析由上海派森諾生物科技有限公司完成。如需進一步討論，歡迎發(fā)郵件或者致電我們喲（郵箱地址：[email protected]，聯(lián)系電話：025-56165883-832）！
文章索引：Li L, Yao R, Olsen R H, et al. Antibiotic resistance and polymyxin B resistance mechanism of Aeromonas spp. isolated from yellow catfish, hybrid snakeheads and associated water from intensive fish farms in Southern China[J]. LWT, 2022: 113802.
