2022-08-09
《Microbial Biotechnology》
影響因子：6.57
文章題目：Identification of VdASP F2-interacting protein as a regulator of microsclerotial formation in Verticillium dahliae
技術手段： RNA-seq；LC-MS/MS；RT-qPCR；
派森諾生物與重慶師范大學攜手合作，于近期在《Microbial Biotechnology》上發表了VdASP F2互作蛋白作為大麗輪枝菌微菌核形成調節因子的鑒定。
研究背景
大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）是一種土壤傳播的植物病原真菌，可導致許多作物萎蔫壞死，造成重大經濟損失。當受到壓力或沒有合適的宿主時，這種真菌會產生黑色素化的微菌核，并在土壤中存活20年，直到條件適合感染，這對大麗輪枝菌的生存與繁殖至關重要。在不利的環境條件下，大麗輪枝菌的分泌蛋白VdASP F2的缺失會顯著影響微菌核的形成。然而，VdASP F2在微菌核形成中的潛在機制尚不清楚。因此，本研究旨在鑒定大麗輪枝菌VdASP F2互作蛋白，并結合轉錄組與蛋白組聯合分析進一步探索VdASP F2互作蛋白參與大麗輪枝菌微菌核形成的功能。
技術路線
研究結果
VdASP F2蛋白定位于細胞壁
通過觀察亞細胞定位實驗，結果顯示VdASP F2-mCherry沒有定位在大麗輪枝菌的細胞膜上，只有少數細胞質區域熒光微弱，這可能表明細胞中沒有分泌出蛋白，而m-Cherry表達的菌株細胞質顯示出強烈的紅色熒光信號。以上結果證實了VdASP F2蛋白定位于大麗輪枝菌的細胞壁上。
圖1 VdASP F2蛋白的亞細胞定位
VdASP F2互作蛋白的鑒定
為闡明VdASP F2在逆境條件下調控大麗輪枝菌微菌核形成的機制，利用液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)分析識別潛在的VdASP F2互作蛋白。該分析發現了大麗輪枝菌基因組中含有一個保守的TRP通道域蛋白的同源序列，并將其命名為VdTRP。考慮到VdASP F2定位于細胞壁，其互作蛋白可能只定位于細胞膜或細胞外空間。因此，選擇MS評分較高的VdTRP作為VdASP F2的候選互作因子，以供進一步研究。
圖2 Pull-down/MS分析表明VdASP F2與VdTRP相互作用
驗證VdASP F2-VdTRP互作
為研究VdASP F2與VdTRP之間的互作，進行了雙分子熒光互補（BiFC）（圖3A）和免疫共沉淀（Co-IP）（圖3B）試驗。兩個試驗的結果都證實了這兩種蛋白的互作，進一步分析了大麗輪枝菌中VdASP F2與VdTRP蛋白的共定位。
圖3 A：BiFC試驗。B：CoIP試驗。C：重組VdASP F2-mCherryFlag與YFP-VdTRP的亞細胞共定位
真菌生長和對非生物脅迫的易感性
通過敲除突變體和回補菌株來研究VdTRP的功能，與無脅迫條件相比，在山梨醇和剛果紅等脅迫條件下，這些菌株徑向生長顯著減少。然而，與野生型V991和回補菌株相比，VdTRP缺失菌株的營養菌絲生長和菌落形態沒有明顯差異（圖4A）。為研究VdTRP在碳吸收或利用特定碳源過程中對大麗輪枝菌生長的作用，所有菌株在不同碳源的培養基上生長沒有表現出明顯的菌落形態(圖4B)。以上結果表明，VdTRP不參與大麗輪枝菌的非生物抗逆性和碳利用機制。
圖4 野生型V991 (WT)、VdTRP缺失突變體(△VdTRP-1/△VdTRP-2)和補充菌株(COM)的菌絲生長
VdTRP參與黑化微菌核的形成，對大麗輪枝菌致病性不是至關重要的
為研究VdTRP在大麗輪枝菌微菌核發育中的作用，在MIM和PDA培養基上培養30 d后野生型V991和回補菌株都產生了顯著的黑化微菌核，而VdTRP敲除突變體后沒有觀察到微菌核（圖5A）。為確定VdTRP的毒力作用，對棉花幼苗進行了致病性測定（圖5B）。通過對缺失突變體的分析揭示了VdTRP是微菌核產生所必需的，而不是大麗輪枝菌抗逆性、碳利用和致病性所必需的。
圖5 A：菌株在固體MIM培養基和PDA培養基上培養。B：用野生型(WT)、VdTRP缺失突變體(△VdTRP-1/△VdTRP-2)和回補菌株(COM)共培養1月齡陸地棉
RNA-seq分析
VdTRP缺失突變體與野生型菌株之間共存在2462個DEGs的功能過程，對這些基因進行GO和KEGG富集分析。在VdTRP缺失突變體的下調基因中，“過渡金屬離子結合”，“膜的組成成分”，“膜的內在成分”基因顯著富集。這些GO數據與VdTRP的亞細胞定位和分子功能密切相關。此外，與刺激反應相關的基因顯著下調，進一步說明了VdTRP與刺激響應存在相關性（圖6A）。KEGG富集分析顯示，萜類和聚酮代謝途徑中有較高比例的基因參與。VdTRP缺失突變體中黑化微菌核形成的缺失與萜類和聚酮代謝途徑基因表達下調一致(圖6B)。同樣，VdTRP缺失突變體中大量跨膜轉運蛋白相關基因也高度上調。以上結果進一步分析了VdTRP在微菌核形成中的調控機制。
圖6 下調差異表達基因（DEGs）的GO注釋和KEGG富集分析
黑色素與微菌核發育的DEGs分析
通過RNA-seq數據分析發現，VdTRP缺失突變體中與黑色素合成和微菌核形成相關的一些差異表達基因顯著下調。MAP激酶介導的信號通路間接調控大麗輪枝菌的致病性和微菌核形成。MAPK相關基因VdAc在VdTRP缺失突變體中也存在表達下調。VDECH在微菌核產生培養中表達下調，在微菌核發育過程中受到抑制，該基因在VdTRP缺失突變體中表達上調，證實了此前在VdCmr1缺失突變體中的發現 (圖7A)。為證實分析結果的準確性，通過定量逆轉錄檢查了這些基因的mRNA水平，結果與轉錄組學分析一致(圖7B)。
圖7 VdTRP缺失突變體及其野生型菌株中黑色素和微菌核生物合成相關基因的轉錄譜
結 論
本研究首先闡明了VdASP F2定位于細胞壁。利用蛋白質體外結合實驗以及液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）分析，確定跨膜離子通道蛋白VdTRP與VdASP F2相互作用的候選蛋白。通過BIFC和CoIP 證實了VdASP F2與VdTRP的互作。通過對缺失突變體的分析揭示了VdTRP是微菌核產生所必需的，而不是大麗輪枝菌抗逆性、碳利用和致病性所必需的。RNA-seq揭示了VdTRP缺失突變體中與黑色素合成及微菌核形成相關的一些差異表達基因顯著下調。綜上所述，VdASP F2通過與VdTRP互作調控黑化微菌核的形成。
本研究中轉錄組與蛋白組的測序和分析由上海派森諾生物科技有限公司完成。
參考文獻：Guo C, Yang X, Shi H, Chen C, Hu Z, Zheng X, Yang X, Xie C. Identification of VdASP F2-interacting protein as a regulator of microsclerotial formation in Verticillium dahliae. Microb Biotechnol. 2022 Jul;15(7):2040-2054. doi: 10.1111/1751-7915.14066.
