2022-08-08
《Microbiological Research》
影響因子：5.070
近日，派森諾生物與華東理工大學合作，在生物學領域的《Microbiological Research》發表新研究成果！
在本研究中，報道了從污水中分離到的兩株新分離的E. piscicida噬菌體，對其形態和基因組進行了分析，結果發現這兩個噬菌體混合物在體外對細菌生長有較好的抑制作用，可作為抗生素的抗菌劑在水產養殖中具有潛在的治療作用。
研究背景
殺魚愛德華氏菌（E. piscicida）是腸桿菌科的一種革蘭氏陰性細菌和胞內病原體，它廣泛存在于海洋中，感染許多商業魚類，包括大菱鲆、斑點叉尾魚、羅非魚和比目魚。E. piscicida可引起腹水病和細菌性敗血癥，并導致內臟器官壞死和潰瘍。水產養殖中使用的抗生素包括β-內酰胺類、氟苯尼考、喹諾酮類、四環素類和葉酸途徑抑制劑，以治療E. piscicida感染。然而，由于耐藥基因的傳播，抗生素的療效正在下降，這種情況重新引起了人們對開發替代策略的興趣，包括使用噬菌體來控制細菌感染。
噬菌體(Phage)是細菌病毒的一種，于20世紀初首次發現。近年來，噬菌體療法被越來越多地作為一種工具來對抗耐多藥細菌。噬菌體具有寄主專一性、抗菌能力強、無毒副作用、環境友好等優點，可作為一種新型的抗菌劑應用于臨床、農業和水產養殖。然而，目前只分離到少數幾個E. piscicida噬菌體，如噬菌體pET-SU和VB_Etam_et-ABTNL-9。到目前為止，該噬菌體還沒有被用于預防和控制水產養殖魚類中的E. piscicida感染。本文報道了從污水中分離到的兩株新分離的E. piscicida噬菌體，對其形態和基因組進行了分析，結果發現其混合物在體外對細菌生長有較好的抑制作用。在斑馬魚和大比目魚模型中，它還提高了存活率并降低了細菌負荷。此外，噬菌體療法還降低了大鼠脾和后腸的炎癥反應。因此，該噬菌體有望成為治療感染E. piscicida的新型抗菌劑。
研究材料與方法
1.實驗材料：污水中分離出噬菌體vB_EpM_ZHS 和vB_EpP_ZHX。
2.測序平臺：Illumina MiSeq
3.分析內容：噬菌體基因組測序、進化樹構建、電鏡實驗、一步增長曲線、宿主范圍鑒定、體外抗菌實驗等。
研究結果
E. piscicida噬菌體的分離與鑒定
從中國上海的市場污水中分離到兩株E. piscicida噬菌體，分別命名為VB_EPM_ZHS和VB_EPP_ZHX。噬菌體VB_EPM_ZHS形成的空斑比噬菌體VB_EPP_ZHX小，并顯示一條堅硬的尾巴，它屬于Myoviridae家族；噬菌體VB_EPP_ZHX顯示一條短尾，屬于Podoviridae家族。一步生長曲線顯示了兩個噬菌體的生長，噬菌體VB_EPM_ZHS的潛伏期為30min，突發量為150pfu/cell。噬菌體VB_EPM_ZHS在20min開始生長，40min達到高峰，爆發量為123 pfu/cell。噬菌體VB_EPP_ZHX進入對數生長期，進入穩定期的速度比VB_EPM_ZHS快。綜上所述，共分離到兩個E. piscicida噬菌體，分屬不同的科，具有不同的生物學特性。
圖1：E. piscicida噬菌體分離
E. piscicida噬菌體宿主范圍鑒定
為了評價噬菌體的特異性，用多種E. piscicida和一些水生病原體測定了噬菌體VB_EPM_ZHS和VB_EPP_ZHX的寄主范圍。這兩種病毒都能感染魚的病原菌--E. piscicida和鰻魚，但不能感染人類的病原體E. piscicida。此外，噬菌體VB_EPM_ZHS和VB_EPP_ZHX不能寄生其他細菌，包括霍希納埃希菌、艾氏埃希氏菌、沙門氏氣單胞菌、普氏假單胞菌、溶藻弧菌、哈維氏弧菌、大腸桿菌。這些結果表明，噬菌體VB_EPM_ZHS和VB_EPP_ZHX特異性地感染了部分E. piscicida。
體外抗菌效果研究
噬菌體VBEPMZHS在MOI100~0.001范圍內使EIB202的生長速度減慢，最大OD600值降低約40%。噬菌體VB_EPP_ZHX在最初的18h內很好地抑制了EIB202的生長，隨后細菌迅速生長，最終細菌濃度與對照組基本相同。噬菌體組合是一種有效的治療策略，通常由幾個噬菌體組成。與單噬菌體相比，VB_EPM_ZHS和VB_EPP_ZHX混合噬菌體在前18h內抑制了EIB202的生長。在MOI100~0.001范圍內，60h內幾乎沒有細菌繼續生長。在此基礎上，VB_EPM_ZHS和VB_EPP_ZHX的雙噬菌體在E. piscicida感染的噬菌體治療中具有巨大的潛力。
噬菌體基因組分析
為了了解新分離的噬菌體的基因組特征，對兩個噬菌體基因組進行了測序和分析。Vb_EPP_ZHX噬菌體基因組為線性dsDNA，全長41,777bp，GC含量為48.11%。預測的ORFs有46個，包括6個結構和包裝蛋白基因、14個代謝基因和26個假想蛋白基因。噬菌體VB_EPM_ZHS基因組大小為71,070bp，GC含量為62.81%。預測的ORFs有110個，包括20個結構和包裝蛋白基因、30個代謝基因和60個假想蛋白基因。在抗生素綜合研究數據庫和毒力因子數據庫中搜索沒有發現抗生素耐藥性或毒力基因。此外，對VB_EPM_ZHS和VB_EPP_ZHX兩個噬菌體分別進行基因組搜索時，沒有發現整合酶基因，表明它們是適合于噬菌體治療的強毒噬菌體。
為了研究兩個噬菌體的系統發育關系，基于dsDNA原核生物病毒數據庫中的所有基因組，使用ViPTree構建了一個環狀蛋白質組樹。結果顯示噬菌體VB_EPM_ZHS屬于肌病毒科，并與其他愛德華氏菌噬菌體形成一個單獨的分支。與Edwardsiella噬菌體KF-1和Edwardsiella噬菌體IW-1關系密切的噬菌體VB_EPP_ZHX屬于Podoviridae科。多重基因組比對顯示，噬菌體VB_EPP_ZHX與噬菌體KF-1的大部分基因高度相似，部分基因與假交替單胞菌噬菌體PH1和弧菌噬菌體VPMS1相似。噬菌體VB_EPM_ZHS與沙門氏菌噬菌體SEN34和冷桿菌噬菌體pOW20-A相似的基因很少。綜上所述，噬菌體VB_EPP_ZHX與已有的Edwardsiella噬菌體相似，而噬菌體VB_EPM_ZHS是一個有待進一步研究的新噬菌體。
圖2：噬菌體基因組特性
噬菌體對斑馬魚感染E. piscicida的治療效果
斑馬魚模型被用來快速評估體內噬菌體治療的療效，用EIB202攻擊斑馬魚，然后用109pfu/ml的噬菌體雞尾酒浸泡感染斑馬魚。治療組的存活率為65%，顯著高于攻擊組的30%。在120HPI范圍內監測細菌載量和噬菌體滴度的動態變化發現，對照組和處理組斑馬魚的噬菌體滴度在120HPI時都保持穩定，而感染稻瘟病菌后，噬菌體滴度在72HPI時略有增加。在攻擊組，細菌負荷逐漸增加，在48HPI達到峰值。在噬菌體處理組中，細菌負荷在24-96 HPI之間顯著低于攻擊組。用EIB202-mCherry感染斑馬魚，觀察其治療效果。48HPI時，治療組的熒光信號明顯低于攻擊組。因此，噬菌體處理可顯著降低EIB202對斑馬魚的致死作用，降低其細菌載量。
圖3：斑馬魚幼蟲噬菌體治療模型
噬菌體對大菱鲆感染E. piscicida的治療效果
為了將混合噬菌體應用于大菱鲆養殖，采用大菱鲆浸泡感染模型進行了驗證。大菱鲆浸泡在E. piscicida中，然后用MOI10~0.1的混合噬菌體治療。在挑戰組中，大菱鲆從18dpi開始死亡，最終存活率為35%。相比之下，MOI為10、1和0.1的治療組的存活率顯著高于對照組，分別為75%、70%和55%。連續21d監測后腸和脾的細菌載量和噬菌體滴度發現，治療組細菌負荷逐漸增加，在14dpi時達到峰值，但最大值顯著低于攻擊組。噬菌體逐漸清除，在14dpi時脾和后腸完全清除。后腸組織的組織病理學顯示，與挑戰組相比，治療組的炎性細胞浸潤明顯減輕，這與預先注射抗鼠傷寒沙門氏菌的裂解噬菌體減輕腸道炎癥一致。總體而言，該混合噬菌體可顯著降低大菱甲魚的死亡率和細菌載量，并減輕浸泡感染E. piscicida后的炎癥反應。
圖4：大菱鲆噬菌體治療模型
噬菌體治療的體內炎癥反應
在噬菌體處理的前7天，大鼠脾和后腸組織中海普西丁和腫瘤壞死因子-α的表達水平與攻擊組相比顯著降低。噬菌體處理后1d和14d，小鼠脾組織中IL-1β的表達水平顯著降低。同時，在后腸，IL-1β的表達水平在1dpi時，治療組和攻擊組較高，但在3dpi時，治療組顯著低于對照組。總體而言，混合噬菌體可以減少由水生埃希氏菌在大菱鲆上引起的炎癥反應，噬菌體在體內可能引起炎癥反應的改變。因此，在模擬組和噬菌體組中檢測了噬菌體對大鼠炎癥反應的影響。當大菱鲆暴露于單獨的噬菌體浸泡處理時，40天內沒有大菱鲆死亡。腫瘤壞死因子-α、IL-12、IL-6和IL-1β的表達水平在1dpi時顯著升高，3dpi時恢復到初始水平，這與給予大腸桿菌噬菌體的結果一致。海普西丁和干擾素-γ的表達水平沒有變化。因此，噬菌體在感染早期引起了一定的炎癥反應，但很快就恢復到正常情況。
結 論
從污水中分離到兩個E. piscicida噬菌體(VB_EPM_ZHS和VB_EPP_ZHX)，經形態和基因組分析分別鑒定為Myoviridae和Podoviridae。該噬菌體混合物在體外對細菌的生長有良好的抑制作用，在斑馬魚和菱鲆模型上也觀察到了治療作用。噬菌體混合物浸泡療法降低了死亡率、細菌載量和炎癥水平，副作用很小。綜上所述，作為抗生素的替代策略，噬菌體混合物療法在水產養殖中具有控制E. piscicida的潛力。
本研究的denovo測序和部分數據分析由上海派森諾生物科技有限公司完成。如需進一步討論，歡迎發郵件或者致電派森諾生物
文章索引：Xu Z, Shao S, Ding Z, et al. Therapeutic Efficacies of Two Newly Isolated Edwardsiella Phages Against Edwardsiella piscicida Infection[J]. Microbiological Research, 2022: 127043.
