2022-08-02
《Applied Materials Today》
影響因子：8.663
文章題目：Convenient in situ synthesis of injectable lysine-contained peptide functionalized hydrogels for spinal cord regeneration
技術(shù)手段：RNA-seq
近期，派森諾生物與南通大學(xué)神經(jīng)再生共同創(chuàng)新中心合作，在《Applied Materials Today》上發(fā)表原位合成可注射功能化水凝膠可用于脊髓再生的研究成果。
研究背景
脊髓損傷是一種世界性的嚴(yán)重疾病，不僅會導(dǎo)致嚴(yán)重的運(yùn)動/感覺功能障礙，還會引起深靜脈血栓形成、肺血栓、疼痛等并發(fā)癥。脊髓損傷后會產(chǎn)生不規(guī)則、復(fù)雜的腔隙。可注射水凝膠能夠精確地原位填充損傷部位，實現(xiàn)脊髓損傷的個性化治療。然而，一種簡單方便的可注射水凝膠功能化方法仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)。本研究通過原位多組分合成布洛芬-KYIGSRK共軛水凝膠，對其進(jìn)行了表征，之后建立大鼠損傷模型，驗證了其在脊髓損傷的修復(fù)作用。這項研究為可注射肽功能化水凝膠的原位合成提供了一條簡便的途徑，可用于治療脊髓損傷或其他生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。
研究路線
研究內(nèi)容
1、可注射功能化水凝膠的制備和表征
該研究通過聚（環(huán)氧乙烷）而丙烯酸酯（PEGDA）和賴氨酸原位邁克爾加成反應(yīng)（圖1A）制備可注射水凝膠，添加布洛芬-KYIGSRK肽（圖1B）后得到功能化可注射布洛芬-KYIGSR共軛水凝膠，之后通過核磁共振（NMR）、高效液相色譜（HPLC）、質(zhì)譜（MS）對其進(jìn)行表征。
圖1：水凝膠的形成機(jī)理與形態(tài)
2、可注射功能化水凝膠的物理化學(xué)性質(zhì)
可注射水凝膠的力學(xué)性能、溶脹比和降解行為是組織工程材料的重要因素。本研究為了研究布洛芬-KYIGSR共軛水凝膠的物理化學(xué)性質(zhì)，測定了軟中硬水凝膠的力學(xué)性能圖（圖2A-G）、溶脹性（2H）和降解性（2I）。接觸角可以反應(yīng)水凝膠的親水性，因此，測定了不同水凝膠的水接觸角（圖3A），結(jié)果表明，布洛芬-KYIGSR提高了水凝膠的親水性。
圖2：水凝膠的物理化學(xué)性質(zhì)
圖3：水凝膠的水接觸角和生物相容性
3、不同水凝膠對DRG神經(jīng)元的再生
通過對原代DRG神經(jīng)元進(jìn)行活/死染色，來確定不同水凝膠表面的細(xì)胞活力（圖3C-D）。為了研究布洛芬-KYIGSRK促進(jìn)神經(jīng)突起延長的潛在機(jī)制，對背根神經(jīng)節(jié)進(jìn)行了全轉(zhuǎn)錄組測序。加布洛芬-KYIGSRK組為實驗組，不加布洛芬-KYIGSRK肽的為對照組。對差異表達(dá)基因繪制了熱圖（圖4A）。與對照組相比，處理組有37個基因上調(diào)表達(dá)，35個基因下調(diào)表達(dá)，如火山圖（圖4B）。同時，對差異表達(dá)的基因進(jìn)行了GO富集分析，發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)的基因主要與神經(jīng)元分化、神經(jīng)元生成、心室祖細(xì)胞分裂、細(xì)胞增殖、中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元分化和發(fā)育途徑有關(guān)（圖4C-D）。
圖4：水凝膠上DRG神經(jīng)元的RNA測序
4、可注射功能化水凝膠在脊髓損傷中的體內(nèi)評價
脊髓損傷后，會產(chǎn)生不規(guī)則空腔區(qū)域，用可注射的布洛芬-KYIGSRK共軛軟水凝膠填充（圖5Ac）。通過建立SD大鼠T10半橫斷脊髓模型，評價布洛芬-KYIGSRK共軛水凝膠促進(jìn)神經(jīng)再生的療效。PBS、非肽結(jié)合水凝膠和布洛芬-KYIGSRK共軛水凝膠注射到脊髓損傷，發(fā)現(xiàn)用布洛芬-KYIGSRK共軛軟水凝膠治療后，病變面積最低（圖5D），布洛芬-KYIGSRK共軛水凝膠組顯著改善了足跡協(xié)調(diào)行為（圖5E）。
對病變區(qū)域的再生能力（圖6）進(jìn)行了檢查。結(jié)果表明，布洛芬KYIGSRK共軛水凝膠有效抑制了神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的過度聚集，并促進(jìn)了受損脊髓中神經(jīng)絲的神經(jīng)再生。
M1巨噬細(xì)胞通過分泌促炎細(xì)胞因子參與陽性免疫反應(yīng)，而M2巨噬細(xì)胞主要通過分泌抗炎細(xì)胞因子下調(diào)免疫反應(yīng)。通過對巨噬細(xì)胞進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色，觀察受損脊髓中的炎癥反應(yīng)（圖7）。發(fā)現(xiàn)布洛芬KYIGSRK軟水凝膠有助于損傷的修復(fù)。
圖5：肽功能化水凝膠治療脊髓損傷的功能恢復(fù)
圖6：經(jīng)水凝膠治療的受損脊髓的神經(jīng)突起和膠質(zhì)瘢痕標(biāo)記物染色
圖7：用水凝膠治療的損傷脊髓的炎癥標(biāo)記物染色
研究結(jié)論
本研究提出一種通過原位多組分合成法構(gòu)建含賴氨酸肽的結(jié)合水凝膠，用于治療脊髓損傷的新策略。在丙烯酸酯和氨基之間不加催化劑的情況下，通過邁克爾加成合成了穩(wěn)定的水凝膠。通過活/死染色表明布洛芬-KYIGSRK水凝膠促進(jìn)了DRG神經(jīng)元的粘附和增殖。此外，在脊髓損傷模型中，注射布洛芬KYIGSRK軟水凝膠填充不規(guī)則空腔區(qū)域，證明了其促進(jìn)神經(jīng)再生和抑制炎癥反應(yīng)。動物足跡分析表明，布洛芬KYIGSRK軟凝膠有效改善了運(yùn)動恢復(fù)能力。這種可注射、生物相容性布洛芬KYIGSRK水凝膠為有效治療不規(guī)則脊髓損傷提供了一種有前途的簡便策略。
本研究的RNA測序和分析由上海派森諾生物科技有限公司完成。
原文索引：Luzhong Zhang, Ke Yao, Jingjing Wei, Guicai Li, Ying Lin, You Lang Zhou, Yumin Yang, Convenient in situ synthesis of injectable lysine-contained peptide functionalized hydrogels for spinal cord regeneration, Applied Materials Today, Volume 27,2022,101506,ISSN 2352-9407,
