2022-08-01
《frontiers in Microbiology》
影響因子：6.064
近日，派森諾生物與浙江工業大學合作，在基因組學領域的《frontiers in Microbiology》發表新研究成果！本研究從肺炎克雷伯菌(K. pneumoniae)噬菌體中鑒定到了一種新型的噬菌體編碼多糖降解酶K19-Dpo41，且該酶對K19型K. pneumoniae具有特異性的抑制活性。本研究結果為K19-Dpo41不僅在K19型K. pneumoniae莢膜分型中有效提供了有力的初步證據，而且有望在未來開發新的替代治療K19型CRKP感染的治療策略。
研究背景
肺炎克雷伯菌(K. pneumoniae)是一種條件致病菌，可引起多種感染，包括尿路感染、菌血癥、肺炎和肝膿腫。自1996年發現第一株含有碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌以來，耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(CRKP)很快流行起來，這凸顯了包裝可用抗生素的問題和對替代治療的需求。近年來，CRKP和K. pneumoniae菌株在全球的傳播顯著放大了該病原體的危害，為有效的病原體控制帶來了新的挑戰。所有這些因素都表明，K. pneumoniae是公共衛生的一個主要問題。
莢膜多糖(CPS)，又稱K抗原，是包圍K. pneumoniae細胞的最外層莢膜層，是K. pneumoniae的重要毒力因子和防御屏障，它使細菌通過克服免疫系統的保護機制在宿主體內生存。該膠囊阻礙抗菌肽的殺菌作用，并阻斷補體成分，防止補體介導的殺傷。它進一步損害免疫細胞對K. pneumoniae的吞噬和調理吞噬作用。而噬菌體編碼莢膜解聚酶是噬菌體降解宿主細菌CPS的一種酶。最近，對莢膜解聚酶的研究表明，每一種解聚酶都對特定的CPS層具有高度特異性，表明它們可以作為一種簡單而經濟的方法來區分莢膜類型，并作為相應莢膜類型的肺炎克雷伯菌菌株的抗菌劑。囊狀解聚酶的這些特性在抑制CRKP方面具有很大的潛力，因此受到了廣泛的關注。截至目前，已發現并報道了23種K型肺炎莢膜解聚酶。其中K19型K. pneumoniae血清型是中國上海當地醫院CRKP樣本人群中第二大流行血清型，也是日本、馬來西亞、新加坡、泰國和越南當地中國成人和海外華人人群中第三大流行血清型。然而，目前還沒有關于特異性靶向K19型K. pneumoniae的解聚酶的報道。在本研究中，首次鑒定出一種新的噬菌體來源的解聚酶，該酶特異性靶向k19型K. pneumoniae。結果表明，該解聚酶在推進K19型CRKP感染的莢膜分型和治療方面具有很大的潛力。
研究材料與方法
>>> 1.實驗材料:
上海交通大學醫學院瑞金醫院原污水中分離得到的SH-KP156570噬菌體
>>> 2.測序平臺：
Illumina Hiseq
>>> 3.分析內容：
噬菌體基因組測序，噬菌體一步生長曲線、宿主譜分析，重組解聚酶的克隆、表達、純化，解聚酶活性測序，抗血清檢測，大蠟螟幼蟲感染模型等。
研究結果
K. pneumoniae耐藥性及莢膜基因型研究
29株臨床分離株均為CRKP，對多種抗生素耐藥，如頭孢呋辛(CXM, 28/29)、阿米卡星(AMK, 15/29)、哌拉西林-他唑巴坦(TZP, 28/29)、左氧氟沙星(LVX, 27/29)、環丙沙星(CIP, 27/29)、頭孢他啶(CAZ, 29/29)、頭孢哌酮舒巴坦鈉(CSL, 27/29)、頭孢吡肟(FEP, 29/29)、亞胺培南(IPM, 19/29)、美羅培南耐藥(MEM, 28/29)、甲氧芐啶-磺胺甲惡唑(SXT, 17/29)和唑曲南(ATM, 27/29)。
表1：噬菌體SH-KP156570和解聚酶K19-Dpo41的宿主譜分析
SH-KP156570噬菌體對k19型K. Pneumoniae特異
將噬菌體擴散到K. Pneumoniae 6570株上，形成雙層瓊脂平板，觀察到清除的斑塊形成和微弱的暈圈。微弱光暈的大小隨著時間的推移而增加，根據之前的研究，猜測可能存在噬菌體衍生的解聚酶。為了了解SH-KP156570與莢膜類型的關系，采用斑點試驗對所有29株SH-KP156570進行宿主譜分析。隨著時間的推移，所有20株K19型菌株均出現微弱暈圈和鼠疫，而9株非K19型菌株則沒有斑塊或暈圈。結果表明，SH-KP156570噬菌體只針對K19 CPS具有特異性。
圖1：SH-KP156570噬菌體的鑒定
SH-KP156570生命周期的測定
SH-KP156570的生長周期為一步生長曲線。噬菌體潛伏期為6分鐘，隨后噬菌體子體上升，直到9分鐘達到靜止噬菌體。爆發大小約為每個感染細胞80 PFU。
SH-KP156570噬菌體基因組DNA測序及注釋
SH-KP156570噬菌體的基因組大小為38667 bp, GC含量為50.85%。基因預測得到47個ORF，其中有29個(61.7%)編碼假定的功能蛋白。這些ORFs的平均大小為851 bp。噬菌體編碼蛋白根據其功能可分為:DNA包裝和形態相關蛋白(6種)、DNA復制/重組/修飾蛋白(16種)、宿主溶解蛋白(4種)和未知蛋白(3種)，其余基因編碼為假定蛋白。在SH-KP156570基因組中未發現整合酶基因、毒力因子、毒素或耐藥性基因。編碼尾纖維蛋白的ORF41基因(2292bp)被預測為解聚酶編碼基因（CPS）。ORF41蛋白n端保守結構域(11 ~ 113 aa)與T7噬菌體n端序列高度相似，而中部區域(252 ~ 296 aa)與果膠裂解酶高度相似。該ORF蛋白含有一個β-螺旋果膠裂解酶結構域，與來自大腸桿菌噬菌體CBA120的尾刺蛋白TSP3。上述結果提示ORF41蛋白可能是SHKP156570噬菌體中的一種多糖解聚酶。
圖2：噬菌體SH-KP156570基因組的生物信息學分析
重組解聚酶K19-Dpo41的解聚活性
將SH-KP156570噬菌體ORF41基因克隆到pSUMO3表達載體中，重組K19ORF41-pSUMO3蛋白經Ni-NTA柱純化表達。經SDS-PAGE凝膠分析，純化后的K19-Dpo41(約84 kDa)純度達95%以上。將純化的重組解聚酶K19-Dpo41稀釋至不同濃度(4.2μg/mL ~ 0.42 mg/mL)進行斑點試驗，評價多糖解聚活性。K19-Dpo41濃度低至4.2μg/mL時，可觀察到清晰的光暈。SEC-HPLC結果證實K19-Dpo41對肺炎克雷伯菌6570株CPS有解聚作用。未處理的CPS顯示單峰，停留時間為12 - 16分鐘。然而，在37?C下與K19-Dpo41孵養30分鐘后，CPS的峰值消失，表明CPS被K19-Dpo41降解。
圖3：重組解聚酶K19-Dpo41的表達及解聚活性
用斑點法檢測K19-Dpo41對29株K. Pneumoniae活性發現，在K19型K. Pneumoniae培養板上，重組蛋白K19-Dpo41產生半透明的暈圈。非K19型K. Pneumoniae未見透明斑形成。結果表明，解聚酶K19-Dpo41與親本噬菌體SHKP156570一樣，對K19型K. Pneumoniae具有特異性。
K19-Dpo41增加K. Pneumoniae 6570株對血清殺傷的敏感性
孵育1 h后，K19- dpo41處理后的菌群存活率較未處理菌群及K64-ORF41處理后的菌群存活率降低約70%，表明K19- dpo41可提高K19型K. Pneumoniae對血清殺傷的敏感性。
圖4：K19-Dpo41對抗肺炎克雷伯菌感染的影響
K19-Dpo41對大蠟螟肺炎克雷伯菌感染模型的影響
采用anti-K. Pneumoniae感染大蠟螟幼蟲模型，評價K19-Dpo41對K. Pneumoniae的感染效果。結果表明，在K. Pneumoniae感染組，90%的幼蟲注射肺炎克雷伯菌6570株后3 d內死亡。而K19-Dpo41單次給藥30 min可使幼蟲存活率提高到50%，同樣給藥5 min可達到70%。注射PBS組未見幼蟲死亡。
結論
研究表明來自SH-KP156570噬菌體的新型解聚酶K19-Dpo41能夠降解K19型K. Pneumoniae的莢膜，促進細菌對血清補體裂解的敏感性，并有效提高大蠟螟幼蟲在體內感染模型中的存活率。本研究鑒定的這種解聚酶及其酶活性肯定會被發現在治療、預防和控制嚴重CRKP感染以及更準確、高效的莢膜分型方面有益的應用。
本研究的denovo測序由上海派森諾生物科技有限公司完成。如需進一步討論，歡迎發郵件或者致電我們喲（郵箱地址：[email protected]，聯系電話：025-56165883-832）！
文章索引：Hua Y, Wu Y, Guo M, et al. Characterization and Functional Studies of a Novel Depolymerase Against K19-Type Klebsiella pneumoniae[J]. Frontiers in Microbiology, 2022, 13.
