2022-07-18
《viruses》
影響因子：5.818
近日，派森諾生物與內蒙古農業大學合作，在病毒領域的《viruses》發表新研究成果！本研究從雞中分離得到3個傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）SH2016、GD2018和SH2017，對其進行表型測定和高通量測序，結果顯示這三個病毒株核苷酸同源性非常高。這3個具有較高遺傳同源性的ILTV在不同培養體系中的復制及對雞的致病性均存在顯著差異，為研究ILTV致病性的關鍵決定因素提供了基礎材料。
研究背景
禽傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)又稱皰疹病毒I型，隸屬于伊爾托病毒屬、甲型皰疹病毒亞科和皰疹病毒科。雞傳染性喉氣管炎(ILT)是由雞傳染性喉氣管炎(ILT)引起的一種急性、高度傳染性的呼吸道傳染病，給世界養禽業造成了巨大的經濟損失。ILT最早于1925年在美國被描述，并于20世紀60年代在中國貴陽首次報道。ILT的臨床癥狀是流鼻水、結膜炎、產卵量減少、喘息、咳嗽、咳出血性粘液，以及明顯的呼吸困難，可能導致窒息，ILT的死亡率為5%至70%。
ILTV是一個線性的雙鏈DNA基因組，大小約為150kb，它包含獨特的長(UL)和獨特的短(US)區，兩側分別有反向重復序列(IRS)和末端重復序列(TRS)，基因組通常編碼約80個預測的病毒蛋白開放讀框。采用同源重組敲除技術，成功鑒定出胸苷激酶(TK)、gJ、gG、UL47等毒力相關因子。然而，決定ILTV毒力的關鍵氨基酸仍不清楚。已知致病性和全基因組序列的ILTV信息有限，無法了解ILTV毒力差異的分子決定因素。在本研究中，為了研究近期從中國分離的三種ILTV (SH2016、SH2017和GD2018)的基因組差異與復制和致病性表型之間的相關性，比較了它們的全序列、在雞來杭雞雄性肝細胞(LMH)上的復制、在 CAMs和在SPF雞胚尿囊液中的復制以及它們在雞體內的致病性。
研究材料與方法
1.實驗材料
于2016年、2017年和2018年從上海(SH)和廣東省(GD)養雞場分離得到3個ILTV，分別為SH2016、SH2017和GD2018。
2.測序平臺
Illumina Miseq
3.分析內容
病毒全基因組測序+組裝+注釋、全基因組進化樹構建、增殖實驗、雞模型實驗、qPCR實驗等。
研究結果
三種 ILTV 的基因組特征
為了解三個ILTV的基因組特征，對其全基因組進行了完整測序，SH2016、SH2017和GD2018的完整基因組分別為153,805、152,931和153,855 bp，每個基因組涵蓋UL區、IRS、US區和TRS四個區域；3個ILTV基因組的GC含量分別為48.16%、48.06%和48.10%。3個ILTV的UL區域為113,157 bp、113,597 bp和112,915 bp ，US區域為13,126 bp、13,094bp和13,192 bp，IRS和TRS區域為13,126 bp、13,120 bp和13,874 bp。從全基因組來看，GD2018和SH2017的核苷酸同源性為99.9%，而SH2016與GD2018和SH2017的核苷酸同源性分別為99.7%。每個病毒基因組包含82個ORF，編碼77種蛋白質，其中31種在三種病毒中具有相同的氨基酸序列。
圖1 基因家族分析
SH2016與SH2017和GD2018在包膜糖蛋白D (gD)、包膜糖蛋白G (gG)、包膜糖蛋白I (gI)、包膜糖蛋白J (gJ)、解旋酶引物亞基、轉錄調節因子ICP4 (ICP4)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶和被膜蛋白VP13/14 (VP13/14) 8個蛋白上存在顯著差異。SH2016與SH2017蛋白同源性分別為98.3%、97.3%、98.3%、99.1%、99.2%、99.3%、98.9%、99.3%，與GD2018蛋白同源性分別為98.7%、97.3%、98.1%、99.1%、99.2%、99.2%、98.9%、99.3%。而SH2017的gG、gJ、ICP4和VP13/14與GD2018的氨基酸序列同源性為100%，表明SH2017與GD2018的關系比SH2016更密切。
三種ILTV的系統發育
為了分析不同 ILTV 分離株的進化關系構建了進化樹，結果顯示SH2016與另一個中國菌株WG在系統發育樹中位于亞系II，而SH2017和GD2018位于亞系I上。進化樹結果顯示，SH2016表明這種分離株可能是從澳大利亞進口的疫苗株進化而來的。SH2017和GD2018的核苷酸同源性為99.9%，而SH2016與SH2017和GD2018的核苷酸同源性為99.7%，表明SH2016在中國獨立于SH2017和GD2018進化而來。SH2017與美國使用的兩種疫苗株密切相關，表明該分離株可能是從美國進口的疫苗株進化而來的。
圖2 ILTV系統發育樹
ILTV的增殖實驗
為了比較三種ILTV的增殖效率，病毒分別在LMH細胞、SPF雞胚的CAM或SPF雞胚的尿囊液中培養。在T25培養瓶中以0.01的MOI接種病毒感染單層LMH細胞，感染后每24小時收集培養上清液進行病毒滴定。GD2018 在感染后24小時在96孔板上的LMH 細胞上可檢測到，而SH2016和SH2017直到感染后48小時才可檢測到。在所有檢測時間點，GD2018的滴度均顯著高于其他兩個分離株。雖然SH2016的滴度在48小時時高于SH2017，但兩種病毒在96小時和120小時的滴度趨于相同。
圖3 ILTV在不同體系中的增殖
為了比較CAM上的復制，通過SPF雞胚蛋的人工氣囊將100個EID 50病毒中的每一個接種到CAM上。每24小時收集三個感染每種病毒的 CAM，并均質化以制備用于病毒滴定的上清液。SH2016和GD2018在48 hpi時在CAM上可檢測到，而SH2017直到72 hpi 才可檢測到。在72、96和168 hpi，GD2018的滴度顯著高于其他兩個分離株。與成對病毒滴度相比，GD2018在除144 hpi以外的72 hpi后的所有檢測時間點均顯著高于SH2016，在24、72、96、144、144 hpi顯著高于SH2017。自48 hpi以來，SH2016的滴度與SH2016的滴度沒有顯著差異。為了比較尿囊液中的復制，100 EID 50的ILTV被接種到SPF雞胚蛋的尿囊腔中。與CAM相比，SH2017和GD2018在尿囊液中的復制能力較差，SH2017在120和168 hpi的測試時間可以檢到低滴度，而GD2018直到168 hpi才能檢測到。雖然SH2016在尿囊液中的復制能力是三個分離株中最好的，但直到72 hpi才被檢測到，直到168 hpi才達到最高滴度，這表明SH2016在尿囊液中的增殖比在雞胚的CAM上慢。
ILTV對雞的致病性
為了測試 ILTVs 的致病性，選取8周的SPF 雞接受10 4.5 EID 50的實驗。結果顯示感染SH2016的9只雞中有2只在攻擊后4天出現結膜炎或過度流淚的臨床癥狀。所有感染 SH2016的雞都表現出臨床癥狀，9只雞中有5只在攻擊后6天表現出嚴重的呼吸道癥狀、窘迫和抑郁。感染SH2017或GD2018的9只雞中有4只在攻擊后6天出現臨床癥狀。感染SH2017的2只雞出現嚴重的呼吸窘迫和抑郁，而感染GD2018的4只雞的臨床癥狀為輕度或中度。SH2016發病率為100%，SH2017和GD2018發病率分別為44.44%。感染SH2016和SH2017的雞在攻毒后10天內恢復，而感染GD2018的人則在8天內康復。臨床癥狀在用SH2016攻擊后6天和用SH2017和GD2018攻擊后7天達到高峰。SH2016、SH2017和GD2018的臨床峰值指數分別為2.2、0.8和0.8，表明SH2016為高致病性菌株，SH2017和GD2018為低致病性菌株。
圖4 不同ILTV分離株感染雞的臨床指標
為檢測感染ILTVs后雞的病理變化，每組3只雞實施安樂死，攻擊后6天大體解剖觀察其器官。與PBS對照組相比，3只感染SH2016 的雞和1只感染SH2017的雞出現出血性氣管炎并伴有血栓。另外2只感染SH2017的雞和3只感染GD2018的雞的喉氣管病變情況不清楚。感染不同ILTV的雞的其他器官未發現病理變化。通過實時PCR對不同組織中的病毒進行檢測和定量。在感染SH2016和SH2017的3只雞和感染GD2018的1只雞的喉氣管組織中檢測到病毒。在脾臟、法氏囊、肺、胸腺和盲腸組織中未檢測到病毒。SH2016和SH2017感染雞的喉氣管組織中病毒基因組拷貝數分別為7.24±1.36 log10/g和6.16±1.22 log10/g，唯一一只感染GD2018陽性雞的拷貝數為5.95 log10/g 。
圖5 感染雞喉、氣管的病理變化
雞的免疫反應
為了檢測感染不同ILTV的雞的免疫反應，在攻擊后0、14和21天收集血清，通過 ELISA 測定法測量抗體。攻擊后0天收集的血清抗ILTV抗體呈陰性，其OD 450值小于0.3。所有感染ILTV的雞的血清在攻擊后14天和21天都轉化為抗ILTV抗體陽性，這表明三種ILTV分離株可以在所有通過滴眼感染的雞中很好地復制。
圖6 ILTV誘導雞產生抗體
結 論
對三個ILTV分離株的全基因組進行了測序，并比較了它們的差異。盡管整個基因組共享超過 99.7% 的核苷酸同源性，但在三個 ILTV 中發現復制培養系統和雞的致病性存在顯著差異，這可能是由于 gD、gG、gI、gJ、解旋酶- primase 亞基、ICP4、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 US3 和 VP13/14。假設上述蛋白質中的突變位點通過影響蛋白質功能來影響ILTV的生長特征和毒力和致病性，并將在接下來的研究中重點關注上述蛋白質中與毒力和致病性相關的突變氨基酸。該研究為研究ILTV復制和致病性的關鍵決定因素提供了基礎信息。
本研究的denovo測序和部分數據分析由上海派森諾生物科技有限公司完成。如需進一步討論，歡迎發郵件或者致電我們喲（郵箱地址：[email protected]，聯系電話：025-56165883-832）！
文章索引：Wu M, Zhang Z, Su X, et al. Biological Characteristics of Infectious Laryngotracheitis Viruses Isolated in China[J]. Viruses, 2022, 14(6): 1200.
