2022-07-12
《Food Chemistry: Molecular Sciences》
影響因子：9.231
文章題目：Comparative metabolome and transcriptome analyses of the properties of Kluyveromyces marxianus and Saccharomyces yeasts in apple cider fermentation
技術手段：RNA-Seq、揮發性代謝組學、LC-MS代謝組學
派森諾生物與復旦大學攜手合作，于近期在《Food Chemistry: Molecular Sciences》上發表關于馬克斯克魯維酵母與傳統酵母發酵蘋果酒的轉錄組學和代謝組學聯合分析的相關研究成果。
研究背景
在傳統的蘋果酒釀造過程中，由原生微生物進行的發酵通常持續數周，其中酵母菌是蘋果酒生產過程中主要釀酒酵母。但是，為了加速發酵過程，經常會添加酵母發酵劑。然而，在工業生產中，蘋果酒通常是用特定的發酵劑進行發酵的，如釀酒酵母和貝酵母，以確保發酵的可靠性和最大限度地減少感官偏差，這同時限制了蘋果酒風味的多樣性。近年來，非釀酒酵母菌因其在葡萄酒和蘋果酒中具有改善風味的潛力而受到越來越多的關注。
馬克斯克魯維酵母可以將幾種碳水化合物基質發酵為乙醇，是葡萄酒和蘋果酒的一種新的替代發酵酵母。最近的研究表明，馬克斯克魯維酵母可以提高葡萄酒的產量，并明顯改變了葡萄酒的香氣特征。然而，馬克斯克魯維酵母在蘋果酒發酵中的代謝變化還有待進一步研究。本研究的目的是比較馬克斯克魯維酵母與傳統酵母菌發酵蘋果酒的代謝物成分差異。同時，我們還進行了轉錄組分析，以揭示產生這種代謝差異的分子機制。
技術路線
研究結果
1. 蘋果酒中的揮發性化合物
從蘋果汁（CK）和三種蘋果酒（KM、SC和AQ）中共檢測出102種揮發性化合物。在蘋果汁中檢測到48種揮發性物質，而分別用KM（K. marxianus Fim-1）、SC（S. cerevisiae S288C）和AQ（S. cerevisiae SY）發酵的蘋果酒中分別檢測到48種、58種和60種揮發性物質。這些風味化合物主要分為醇類、酸類、酯類和羰基類(表1)。
表1 蘋果汁和三種蘋果酒中揮發性代謝物
利用主成分分析(PCA)對不同樣品中的揮發性成分進行降維分析(圖1)。如圖1所示，PC1和PC2的貢獻率分別為52.39%和26.02%，三種蘋果酒中的主成分區分明顯。但與SC和AQ蘋果酒不同的是，KM蘋果酒的主成分與蘋果汁的主成分相關性較好。在檢測到的揮發性化合物中，1-己醇、己酸乙酯、乙酸己酯、2-苯乙醇和癸酸乙酯對PC1的變異貢獻較大。
圖1 蘋果汁和蘋果酒樣品中揮發性成分的主成分分析圖
總的來說，酵母發酵蘋果汁顯著提高了其揮發性成分的含量，改變了其香氣組成。蘋果汁中主要成分為醛類和醇類，分別占總揮發分的43.6%和29.8%。在蘋果酒樣品中，醇類(63.3 77.8%)和酯類(17.3 30.4%)是主要揮發成分。在三種蘋果酒中，酯和揮發性酸的組成也有顯著差異。酵母菌SC和AQ發酵的蘋果酒中以乙酯、辛酸和癸酸為主要成分，KM發酵的蘋果酒中以乙酸乙酯和乙酸為主要揮發物。由此可見，KM發酵的蘋果酒可能比酵母菌發酵的味道更甜。與實驗室酵母菌株SC相比，工業菌株AQ在發酵過程中產生了更多的脂肪酸和酯。
2. 蘋果酒中的非揮發性化合物
表2列出了在不同樣品中檢測到的一些非揮發性化合物，包括類黃酮、酚酸、有機酸和氨基酸。與可滴定酸的滴定結果一致，發酵后所有蘋果酒樣品中酚酸和有機酸的含量均明顯增加。但KM發酵的蘋果酒的可滴定酸含量最高(表3)。在已鑒定的有機酸中，發酵后的所有蘋果酒中異檸檬酸、琥珀酸、乳酸苯酯和蘋果酸的含量均顯著增加。雖然三種蘋果酒的非揮發性成分分布非常相似，但這些非揮發性成分的含量卻存在顯著差異。與用酵母菌發酵的蘋果酒相比，KM蘋果酒的橙皮素、槲皮素、咖啡酸、水楊酸和氨基酸含量較高。
表2 用超高效液相色譜-質譜法測定蘋果汁和蘋果酒中的非揮發性化合物
表3 蘋果汁及蘋果酒的理化參數
在蘋果酒發酵過程中，果汁中的氨基酸是酵母生長的主要氮源，同時也參與揮發性化合物的合成和代謝。如圖2所示，除了蘋果酸外，KM發酵的蘋果酒中涉及TCA循環、氨基酸生物合成和代謝途徑的代謝產物明顯高于SC和AQ發酵的蘋果酒。這可能是因為KM在TCA循環和氨基酸生物合成方面的代謝通量可能比酵母菌更高，從而減少了蘋果汁中氨基酸的攝入和同化。KM中氨基酸代謝的差異可能有助于提高蘋果酒的品質和營養價值。
圖2 不同蘋果酒樣品有機酸及氨基酸代謝途徑分析（紅色表示KM蘋果酒的代謝產物含量高于SC或AQ蘋果酒；藍色表示KM蘋果酒的含量低于SC蘋果酒或AQ蘋果酒；灰色:未檢測到。）
3.差異表達基因的GO、KEGG富集分析
通過比較發酵過程初始和發酵后期的轉錄組結果，分析了三種酵母的差異表達基因（DEGs）。KM、SC和AQ菌株在兩個發酵階段分別有1487、631和932個基因表達差異。為了確定這些DEGs的生物學功能，我們對所有DEGs進行了GO分析，主要分類如圖3A所示。KM主要富集酸(羧酸、有機酸和氧化酸)、氨基酸和有機氮化合物代謝過程，而兩種酵母菌均顯著富集碳水化合物代謝、氧化還原和rRNA相關過程。GO聚類分析表明，KM蘋果酒中較高的氨基酸和有機酸含量與其合成代謝途徑密切相關。
如圖3B所示，碳水化合物代謝、氨基酸代謝和轉錄是三種酵母菌株之間差異顯著的主要途徑。在KM中，DEGs在丙酮酸和氨基酸代謝途徑中顯著富集。這可能是km發酵蘋果酒中氨基酸含量高于酵母菌發酵蘋果酒的一個因素(表2)。GO分析表明，SC和AQ菌株中的deg被富集成具有相似生物功能的聚類，但在KEGG途徑富集分析中它們被劃分為不同的生物途徑。特別是在SC菌株中，糖酵解、檸檬酸循環和脂肪酸降解途徑的基因在兩個發酵階段表達顯著差異。然而，在AQ菌株中，DEGs在RNA聚合酶和核糖體生物發生途徑中富集。
圖3 蘋果酒發酵過程中KM、SC和AQ酵母中DEGs的GO (A)和KEGG (B)富集分析
圖4顯示了三種菌株在蘋果酒發酵過程中參與糖酵解和丙酮酸代謝途徑的關鍵基因表達量的變化。結果表明，己糖激酶、磷酸果糖激酶等關鍵基因在KM菌株中的表達量明顯高于酵母，說明KM菌株可能具有較高的糖酵解率。此外，乙醇脫氫酶基因ADH1、ADH2和ADH6在KM菌株中顯著上調，而丙酮酸脫氫酶亞基基因PDB1、醛脫氫酶基因ALD2和ALD6以及乙酰輔酶a合成酶基因ACS1和ACS2明顯下調，表明KM在厭氧條件下更傾向于產生乙醇而不是產生乙酰輔酶a。KM菌株中檸檬酸合酶基因CIT1和CIT3的低表達可能有助于KM蘋果酒中乙酸乙酯的積累(表1)。
圖4 KM、SC和AQ菌株的中心碳代謝及乙醇和酯合成相關表達基因的通路分析
文章小結
以馬克斯克魯維酵母(K. marxianus)和釀酒酵母S288C和SY為原料，在靜態條件下對蘋果汁進行發酵。酵母發酵顯著改變了蘋果汁的揮發性和非揮發性組分，其中醛類含量急劇下降，高級醇類、脂肪酸、酯類、酚酸和有機酸含量顯著增加。在蘋果汁中，醛類和醇類是主要的香氣成分；蘋果酒的主要成分是醇類和酯類。以SY酵母菌發酵的蘋果含有較多的乙基酯、辛酸和癸酸。相比之下，KM在蘋果酒發酵過程中產生了更多的乙酸酯和乙酸，豐富了蘋果酒的口感和多種香氣。轉錄組分析揭示了KM和酵母菌在蘋果酒發酵過程中葡萄糖、有機酸和氨基酸代謝途徑活性的差異。在初始發酵階段，KM的糖酵解和乙醇發酵代謝通量高于酵母菌。總之，KM降低了乙酸合成乙酰輔酶A及其進入TCA循環的代謝通量，增加了乙酸乙酯及相關酯的合成。
本研究中轉錄組和代謝組的檢測與數據分析工作由上海派森諾生物科技有限公司完成。
原文索引：https://doi.org/10.1016/j.fochms.2022.100095
