《International Journal of Food Microbiology》
派森諾與江蘇大學(xué)合作，在食品微生物領(lǐng)域《International Journal of Food Microbiology》發(fā)表新研究成果！本研究從雞糞便中，分離到產(chǎn)氣莢膜梭菌特異性裂解新噬菌體HN02，該噬菌體具有良好的pH和溫度耐受性、宿主范圍較廣。通過(guò)裂解活性試驗(yàn)，噬菌體HN02表現(xiàn)出良好的抗菌作用，可作為抗裂劑肉制品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的生物防治劑。
產(chǎn)氣莢膜桿菌（C. perfringens）是革蘭氏陽(yáng)性、厭氧、產(chǎn)孢子的桿菌，通常存在于人和動(dòng)物的腸道中。C. perfringens的產(chǎn)腸毒素菌株可引起食物中毒，如造成人類腹瀉和急性腹部絞痛，這被認(rèn)為是工業(yè)化國(guó)家常見的細(xì)菌食物中毒劑。目前，大多數(shù)的干預(yù)措施包括用化學(xué)添加劑(硝酸鹽和亞硝酸鹽、磷酸鹽、有機(jī)酸)加熱或處理食品，這些添加劑會(huì)對(duì)產(chǎn)品的味道和質(zhì)量產(chǎn)生不利影響。
噬菌體(噬菌體)和內(nèi)毒素等一直備受關(guān)注，噬菌體可以作為抗生素的有效替代品來(lái)控制病原體。許多研究集中在開發(fā)噬菌體或噬菌體溶菌素來(lái)對(duì)抗與肉雞壞死性腸炎密切相關(guān)的C. perfringens。在本研究中，分離得到一種新的噬菌體HN02作為預(yù)防和控制雞產(chǎn)C. perfringens的替代方法。本研究結(jié)果為控制C. perfringens在雞體內(nèi)的污染和控制C. perfringens中毒事件的發(fā)生提供了一種新的途徑。
在陜西省養(yǎng)雞場(chǎng)從雞糞便中分離到C. perfringens菌株ATCC 13124和20株其他產(chǎn)氣莢膜梭菌。以ATCC 13124為宿主菌株，從中分離出噬菌體。
噬菌體基因組組裝注釋、系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建、宿主范圍鑒定、MOI和一步生長(zhǎng)曲線鑒定、熱穩(wěn)定性和PH穩(wěn)定性鑒定、噬菌體吸附和裂解分析等。
1.C. perfringens噬菌體的分離與鑒定
以C. perfringens ATCC 13124為宿主菌株，從雞糞中分離到一種新的噬菌體HN02。HN02噬菌體能夠在宿主上形成清晰的菌斑，其直徑約為0.1 mm(圖1A)。形態(tài)學(xué)觀察顯示，HN02噬菌體具有等距多面體頭部(直徑為49.38±1.07 nm)和短尾(33.95±1.08 nm)(圖1B)。根據(jù)國(guó)際病毒分類委員會(huì)(ICTV)， HN02被劃入足病毒科。當(dāng)噬菌體感染MOI 1宿主菌株時(shí)，噬菌體的滴度更高，為1.09 × 109 PFU/mL(圖2B)，因此，HN02噬菌體的最佳MOI應(yīng)為1。在最優(yōu)MOI條件下，測(cè)定了植株的一步生長(zhǎng)曲線。從一步生長(zhǎng)曲線看，HN02噬菌體潛伏期約為20 min，平均爆發(fā)大小約為27.67 PFU/細(xì)胞(圖2B)。
圖1 感染C. perfringens的噬菌體vB_CpeP_HN02的特性
圖2 (A)最佳感染多樣性(MOI)；(B)一步生長(zhǎng)曲線
為確定HN02噬菌體的宿主范圍，采用斑點(diǎn)法對(duì)C. perfringens和其他革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌進(jìn)行檢測(cè)。研究人員用20株A型C. perfringens確定了噬菌體HN02的宿主范圍。噬菌體HN02對(duì)C. perfringens分離株的宿主范圍較寬，對(duì)42.86%的分離株有不同程度的裂解作用，這與之前報(bào)道的C. perfringens噬菌體CPS2不同。結(jié)果表明，HN02噬菌體僅能感染C. perfringens，提示該噬菌體可能具有一個(gè)C. perfringens感染的菌株特異性宿主。
HN02的宿主裂解活性應(yīng)在各種壓力條件下保持穩(wěn)定，包括溫度和pH。在30、40、50和60℃孵育30分鐘和60分鐘后，噬菌體pfu數(shù)量沒(méi)有顯著變化。然而，在70℃孵育60分鐘后，噬菌體滴度降低了0.96 log(圖3A)。80℃孵育30 min和60 min后，噬菌體pfu分別降低4.74 log和4.64 log 。所有噬菌體在90℃孵育30分鐘后均死亡。這些結(jié)果表明，噬菌體HN02在低于70℃的溫度下是熱穩(wěn)定的。pH敏感性結(jié)果顯示，噬菌體HN02在培養(yǎng)2 h時(shí)，pH在5-11保持相當(dāng)穩(wěn)定(圖3B)。可以看出，噬菌體對(duì)酸、堿和高溫具有良好的耐受性(圖3B)。
由于吸附是噬菌體感染的第一步，研究人員通過(guò)測(cè)定噬菌體與C. perfringens ATCC 13124孵育后，培養(yǎng)基中自由噬菌體斑塊形成單位來(lái)確定噬菌體HN02對(duì)C. perfringens菌的吸附效果。結(jié)果表明，45%的噬菌體顆粒被ATCC 13124吸附。然而，與ATCC 13124孵育20分鐘后，培養(yǎng)基中游離噬菌體的pfu明顯減少(圖4A)。與C. perfringens噬菌體CPS2相比，HN02的吸附時(shí)間更短，效率更高。MOI為1000時(shí)，5 h內(nèi)噬菌體HN02幾乎能將寄主菌株完全裂解，MOI為100時(shí)寄主濃度雖未下降，但仍能看到一定的抑制活性。同樣，當(dāng)MOI為0.01和0.001時(shí)，宿主菌株的OD600值受到噬菌體的抑制，在孵育4 h內(nèi)生長(zhǎng)緩慢。4 h后，宿主菌株濃度略有下降，與初始水平相當(dāng)(圖4)。因此，在今后噬菌體的應(yīng)用中，用量和裂解時(shí)間應(yīng)加以考慮。
HN02的全基因組為線性雙鏈DNA，長(zhǎng)度為17754 bp，與C. perfringens噬菌體ΦCP24R具有高度的同源性(圖5)。其GC含量低(約28.2%)，編碼率為88.07%，每個(gè)ORF的平均長(zhǎng)度約為710.73 bp，噬菌體HN02的基因組序列在末端有大量的反向重復(fù)，7個(gè)啟動(dòng)子。18個(gè)ORFs與噬菌體ΦCP24R高度相似。在HN02蛋白中發(fā)現(xiàn)的酶包括B型DNA聚合酶(HN02_19)，與噬菌體梭菌ΦCP24R和ΦCPV1的相似性最高。HN02_12經(jīng)鑒定為溶菌酶-肽酶，為足毒病毒科成員所獨(dú)有，它包括一個(gè)尾結(jié)構(gòu)域(PHA00380)、一個(gè)溶菌酶結(jié)構(gòu)域(CL00222)和一個(gè)肽酶結(jié)構(gòu)域(PF01551)。ORF HN02_18與芽孢桿菌噬菌體phi29 DNA包殼蛋白Gp16 (YP_002004545.1)相似，可以通過(guò)DNA包裝atp酶活性形成包裝馬達(dá)。在HN02剩余的預(yù)測(cè)基因中，有8個(gè)與phi24R的假蛋白有顯著相似性，4個(gè)orf在多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)與蛋白質(zhì)無(wú)顯著相似性。
主要衣殼蛋白和大末端酶亞基通常被認(rèn)為是噬菌體的保守序列，已被用于許多噬菌體的系統(tǒng)發(fā)育研究。為研究HN02噬菌體與其他C. perfringens噬菌體之間的關(guān)系，利用MEGA6和噬菌體主要衣殼蛋白(HN02_14)建立系統(tǒng)發(fā)育樹。采用鄰接法，重復(fù)1000次。當(dāng)同源性設(shè)置為30%時(shí)，只有9個(gè)C. perfringens噬菌體蛋白被分類。在主要衣殼蛋白樹中，HN02與噬菌體phi24R (NC_019523.1)和CPD2 (NC_048738.1)形成單獨(dú)的簇(圖6)。這些進(jìn)化分析表明，HN02噬菌體是足病毒科的新成員。HN02與ΦCP24R的同源性最高，這兩種噬菌體均為C. perfringens噬菌體。綜上所述，HN02是一種新型的強(qiáng)毒性噬菌體，對(duì)C. perfringens具有良好的抗菌作用。
6.HN02噬菌體對(duì)雞胸脯產(chǎn)氣莢膜桿菌失活的研究
C. perfringens是與家禽消費(fèi)有關(guān)的普遍的食源性病原體之一。因此，利用噬菌體控制生雞胸肉在屠宰加工過(guò)程中的污染，對(duì)保證食品安全更有意義。在4℃的雞肉中添加稀釋的C. perfringens噬菌體，從1×106 PFU/g到1×1010 PFU/g（圖7）。噬菌體HN02對(duì)C. perfringens表現(xiàn)出典型的劑量依賴性抑制作用。隨著噬菌體劑量的減少，抑制效率也降低。而1×1010 PFU/g噬菌體HN02處理48 h后可完全裂解C. perfringens。C. perfringens數(shù)量的減少與噬菌體密度成正比，即噬菌體濃度越高，C. perfringens數(shù)量的減少幅度越大。在抑菌過(guò)程中，不同組的噬菌體濃度變化不明顯，72h后仍與初始水平相當(dāng)。
圖7 噬菌體HN02基因組啟動(dòng)子的預(yù)測(cè)
本研究評(píng)估了一種新的可溶性噬菌體HN02作為預(yù)防和控制雞C. perfringens的替代方法。研究結(jié)果表明，HN02噬菌體處理人工污染的雞肉后，雞肉表面C. perfringens的數(shù)量明顯減少，且具有較好的耐pH和耐溫性。因此，本研究認(rèn)為HN02噬菌體可用于控制C. perfringens在肉制品尤其是雞肉中的污染，可有效降低該菌污染的風(fēng)險(xiǎn)和由該菌引起的中毒事件的發(fā)生。
本研究的denovo測(cè)序和部分?jǐn)?shù)據(jù)分析由上海派森諾生物科技有限公司完成。如需進(jìn)一步討論，歡迎發(fā)郵件或者致電我們喲（郵箱地址：[email protected]，聯(lián)系電話：025-56165883-832）！
文章索引：Yuan, Tab , et al. "Virulent phage vB_CpeP_HN02 inhibits Clostridium perfringens on the surface of the chicken meat - ScienceDirect." .https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2021.109514
