2022-06-20
《viruses》
影響因子：5.048
近日，派森諾與南京農業大學合作，在病毒基因組領域的《viruses》發表新研究成果！本研究從養雞場污水中分離得到一株產氣莢膜梭菌特異性噬菌體（VB_CPES_BG3P），該噬菌體具有良好的穩定性、中等的耐溫性、廣泛的宿主范圍，且對產氣莢膜梭菌液體培養物具有較好的抑菌效果，但該噬菌體未來的開發和應用可能需要考慮去除類氯霉素耐藥基因或探索其裂解蛋白以用于未來的抗菌應用。
研究背景
產氣莢膜梭菌是一種革蘭氏陽性、嚴格厭氧、芽胞形成的細菌，廣泛分布于自然界。這種病原體的孢子可以在土壤、糞便或環境中存活，這種細菌會導致許多人和動物的嚴重感染，包括人類的食物中毒、氣體壞疽和非食源性胃腸道感染，以及動物的壞死性腸炎。在雞中，產氣莢膜梭菌是壞死性腸炎的主要病原體，其急性形式可導致肉雞死亡率增加。此外，由于這種細菌對腸道粘膜造成損害，亞臨床形式可導致消化減少和體重增加。盡管可以用抗生素控制產氣莢膜梭菌，但禁止在家禽中使用促進生長的抗菌劑的壓力越來越大。
隨著抗藥性病原體的不斷增加，人們對噬菌體生物學以及將噬菌體或噬菌體基因產品用作獸醫和人類醫學的抗菌劑以及世界各地的生物工業重新產生了興趣。以前的研究集中在開發噬菌體或其裂解蛋白來對抗與肉雞壞死性腸炎密切相關的產氣莢膜梭菌菌株，除了噬菌體外，噬菌體衍生的蛋白(內毒素)已被探索為抗這種細菌的抗菌劑；然而，此方法主要的缺點是將這些蛋白輸送到動物體內，因此到目前為止還沒有成功的利用噬菌體裂解蛋白進行體內檢測的報道。由于噬菌體的特異性，大量收集噬菌體對于確保感染盡可能多的菌株是必不可少的。本研究分離并鑒定了一株新的噬菌體感染農場來源的產氣莢膜梭菌，完整的基因組特征和生物學特性指向宿主范圍廣泛的噬菌體。在本研究中將分析該噬菌體的相關裂解作用，以期為家禽養殖業防治產氣莢膜梭菌提供有效的策略。
研究材料與方法
?實驗材料
養雞場污水中分離得到一株產氣莢膜梭菌特異性噬菌體
?測序平臺
Illumina Novaseq
?分析內容
噬菌體基因組測序、系統發育樹構建、噬菌體形態學鑒定、一步生長曲線、噬菌體的熱穩定性和pH穩定性、噬菌體吸附和裂解分析、宿主范圍鑒定分析等等。
研究結果
產氣莢膜梭菌噬菌體的分離與鑒定
在此背景下，幾種產氣莢膜梭菌菌株被用于從農場污水中分離特定的噬菌體。富集并形成菌斑后，僅有C.perfringens BG3菌株出現噬菌體斑塊。該噬菌體名為vB_CpeS_BG3P(下文簡稱BG3P)，能夠在宿主草坪上形成清晰的裂解斑，直徑約為0.1 mm(圖1A)。電鏡下顆粒形態觀察顯示，噬菌體BG3P具有等距多面體頭部(直徑70.20±1.25 nm)，長而不收縮的尾部(169.64±1.84 nm)(圖1B)，國際病毒分類委員會(ICTV)將BG3P噬菌體歸入Siphoviridae。
圖1 產氣莢膜梭菌噬菌體BG3P的特性研究
通過在37℃染產氣莢膜桿菌BG3培養物的MOI為10的一步生長曲線，進一步描述了噬菌體的特征。結果噬菌體潛伏期約為10 min，爆發期約為70 min，侵染細胞平均爆發大小約為18.7 PFU/個。
圖2 一步生長曲線噬菌體BG3P具有廣泛的宿主范圍
噬菌體具有廣泛的宿主范圍
為確定BG3P噬菌體的宿主范圍，采用斑點分析法對產氣莢膜梭菌和其他革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌進行檢測。除4株收集菌株外，還使用了32株C. perfringens。對32株C. perfringens進行PCR擴增4種毒素，結果顯示只有α毒素擴增陽性，因此32株菌均為A型產C. perfringens。噬菌體BG3P對C. perfringens分離株宿主范圍較廣，90.63%(29/32)分離株被噬菌體不同程度抑制。而對其他被測細菌均無裂解活性，表明該噬菌體具有物種特異性宿主范圍譜。
BG3P噬菌體對T溫度和pH的穩定性值得進一步研究
應用該噬菌體作為一種抗菌藥物的開發需要其在高溫和低pH條件下的宿主裂解活性保持穩定。在30℃、40℃和50℃孵育后，沒有觀察到噬菌體數量的顯著變化。然而，在60℃孵育30分鐘和60分鐘后，噬菌體滴度分別降低了2.28 log和3.50 log(圖3A)。70℃孵育后噬菌體效價顯著降低。同樣，當在80℃進行處理時，噬菌體滴度下降到2 log以下。這些結果表明，噬菌體BG3P在低于50℃的溫度下是熱穩定的。就pH敏感性而言，BG3P噬菌體在pH 3 ~ 11范圍內較為穩定(圖3B)。在pH為11時，噬菌體滴度下降1.88單位對數，高于此值時，滴度急劇下降。這說明BG3P噬菌體對酸性環境具有較強的耐受性，對堿性環境的耐受性一般。
圖3 噬菌體BG3P的生物學特性
BG3P的快速吸附和高效裂解活性
噬菌體對宿主細菌的吸附是其生命周期的第一步，對其裂解活性至關重要，在此背景下，通過測定與C. perfringens BG3細胞孵育后培養基中游離PFUs來確定噬菌體BG3P對C. perfringens的吸附。結果顯示，5min時游離噬菌體百分比下降至14%，10min時游離噬菌體百分比下降至10%以下，表明噬菌體BG3P對宿主細胞吸附迅速，吸附率達到90%以上(圖4A)。噬菌體對C. perfringens培養物的體外裂解活性是通過一系列噬菌體濃度(MOIs)和隨時間去除的細菌的挑戰試驗來確定的。此外，還對兩株不同的菌株進行了測試，以比較噬菌體的有效性。結果顯示，在MOI 100 ~ 1000范圍內，BG3P噬菌體能在6 h內完全抑制ATCC 13124的生長(圖4C)。BG3菌株的結果相似，在5小時后略有改善(圖4B)。因此，雖然所有噬菌體濃度對細菌都有抑制作用，但作用時間和程度不同。總的來說，噬菌體對宿主的抑制作用是劑量依賴性的。
圖4 噬菌體BG3P的吸附和裂解活性
噬菌體BG3P基因組序列分析表明它是一種新的噬菌體
噬菌體BG3P為線性雙鏈DNA，基因組大小為43,528 bp，GC含量為28.65%，與C. perfringens噬菌體ΦCP3626和ΦCPSM101具有較高的一致性(圖5)。共鑒定出73個開放閱讀框，orf的平均長度為600.45 bp；本次分析未預測到非編碼RNA編碼基因。NR注釋預測到36個orf，但只有13個(17.81%)具有假定的功能，預測得到的基因均轉錄在正鏈上。大多數蛋白質的同一性百分比都很低，在31.4到100%之間。值得注意的是，8個orf與噬菌體phiSM101的同源性為44.7 ~ 100%。除orf24具有自溶活性外，其余均具有未知的同源性。該蛋白位于holin附近，可能是噬菌體內毒素。7個orfs被鑒定為結構蛋白編碼基因:門戶蛋白(BG3P_05)、頭部形態發生蛋白(BG3P_06)、主要衣殼蛋白(BG3P_11)、尾帶測量蛋白(BG3P_20)、尾蛋白(BG3P_22)、基板蛋白(BG3P_24)和頸傳代結構蛋白(BG3P_25)。本次分析鑒定出屬于裂解模塊的蛋白有holin (BG3P_27)和溶菌酶(BG3P_28)，并將orf BG3P_5標記為編碼一個假定的終止酶大亞基。入口蛋白(BG3P_05)和頭部形態發生蛋白(BG3P_06)與phiSemix9P1編碼的蛋白相似。共鑒定出9個基因編碼蛋白，屬于復制模塊。BG3P_40和BG3P_42分別與梭狀芽孢桿菌噬菌體phiSM101和phiSemix9P1的復制蛋白和轉錄調控因子具有同源性。Orfs BG3P_50、BG3P_52和BG3P_54分別為單鏈DNA結合蛋白、核苷三磷酸水解酶和重組酶，與噬菌體Clostridium phage phiCP9O和Aeribacillus phage AP45蛋白相似。此外，屬于復制模塊的其他蛋白質有BG3P_59，一種金屬依賴的水解酶；BG3P_60，核酸酶；DNA胞嘧啶甲基轉移酶BG3P_64；BG3P_68，與噬菌體EV3的引物相似。值得注意的是，BG3P_15編碼序列與產氣莢膜菌特異性氯霉素抗性基因(WP_111946556.1)同源性高達97.92%。沒有發現任何編碼毒力和整合酶蛋白的基因，也沒有證據表明噬菌體可以溶原化產氣莢膜梭菌。
圖5 基因組圈圖
為了研究BG3P噬菌體與其他C. perfringens噬菌體的關系，利用MEGA10構建了噬菌體ssDNA結合蛋白(orf 50)氨基酸序列的系統發育樹，其中只有orf 50與目前發表的數據具有較高的同源性。當同源性設置為30%時，只有6個產氣莢膜桿菌噬菌體蛋白被分類。在以ssDNA結合蛋白為基礎的樹中，噬菌體BG3P與噬菌體phi3626 (NC_003524.1)形成一個單獨的簇(圖6)。這些系統發育和基因組同源性分析表明，噬菌體BG3P是Siphoviridae的一個新成員。
圖6 系統發育樹
氯霉素抗性基因轉移
結果顯示，72.72%的臨床菌株攜帶該CmR基因，但在宿主菌株BG3基因組中未發現該CmR基因。為了確定該CmR基因orf 15是否會從噬菌體BG3P轉入宿主菌株，用10株CmR陰性產氣莢膜梭菌株感染BG3P噬菌體。結果表明，僅在產氣莢膜梭菌BG4和BC8中，在72 h孵育期間檢測到推定的CmR編碼基因(orf 15)表達，但CT值不高。根據噬菌體BG3P DNA標準運行的標準曲線，可以計算出orf 15在BG4和BC8中的表達拷貝數分別為3.881 × 104 copies/mL和2.307 × 104 copies/mL(圖7)，而且只有BG4和BC8與不含氯霉素的TSC板噬菌體混合(10μg/mL)才能看到克隆；其余8株經噬菌體BG3P孵育后裂解，在TSC平板上無克隆生長。選取BG4和BC8培養的菌落進行厭氧培養，采用orf 15引物進行PCR擴增DNA。結果表明，在這些菌落中均能檢測到orf 15基因，說明orf 15基因可以轉移。此外，還在BG4和BC8中檢測了噬菌體攜帶的orf 5、orf 11、orf 25和orf 28基因，以確定BG3P是否可以轉入宿主，結果表明，這些克隆可以擴增出orf 5、orf 11、orf 25和orf 28，而不能擴增出原BG4和BC8。這可能說明BG3P對產氣莢膜梭菌具有一定的推廣轉導作用，而對其他8株CmR陰性產氣莢膜梭菌無轉導作用。
圖7 CMR陰性產氣莢膜梭菌orf 15基因表達的測定
研究結論
產氣莢膜桿菌是一種常見于土壤和人和動物腸道的致病菌。在這項工作中，分離并鑒定了一種新的噬菌體感染該細菌，并評估其作為生物防治的替代方案。BG3P噬菌體屬于Siphoviridae，與NCBI數據庫中相關C. perfringens噬菌體基因組序列相似區域較少。在體外條件下，其裂解效果具有寄主范圍廣、裂解效率高等特點。值得注意的是，這種噬菌體在堿性環境中也具有很高的穩定性。鑒于BG3P噬菌體宿主范圍廣，對產氣莢膜梭菌具有較高的裂解活性，在進一步研究中，考慮敲除氯霉素類抗性基因，并評價其應用效果和安全性，為產氣莢膜梭菌噬菌體的開發奠定基礎。此外，還發現BG3P_27和BG3P_28編碼穿孔溶菌酶和自溶溶菌酶。因此，在以后的工作中，也會嘗試研究這種酶。
本研究的denovo測序和部分數據分析由上海派森諾生物科技有限公司完成。如需進一步討論，歡迎發郵件或者致電我們喲（郵箱地址：[email protected]，聯系電話：025-56165883-832）！
文章索引：Huang S , Tian Y , Wang Y , et al. The Broad Host Range Phage vB_CpeS_BG3P Is Able to Inhibit Clostridium perfringens Growth. 2022.
