2022-06-20
《genes》
影響因子：4.096
近日，派森諾生物與華中農業大學合作，在微生物基因組領域的《genes》發表新研究成果！本研究旨在探索木質素降解酶編碼基因在瘤胃微生物降解木質素的潛力，為揭示水牛降解木質素的機理提供思路。本文首次報道了水牛瘤胃中分離得到的蠟樣芽孢桿菌（B. cereus）AH7-7能夠降解木質素，并從全基因組水平揭示了木質素降解酶的編碼基因。
研究背景
木質素是一種嵌在植物纖維素和半纖維素之間的極其穩定的芳香族三維聚合物，它會降低飼料的營養價值和利用，阻礙普通動物的消化能力。因此，微生物降解木質素已成為研究熱點。目前已有研究表明變形菌和放線菌是具有降解木質素功能的主要細菌門，然而大多數木質素降解菌在全基因組水平上的基因組特征仍不清楚。
水牛對粗飼料具有較強的耐受性，是首個能高效降解木質素的哺乳動物。研究發現，水稻秸稈粗飼料在水牛瘤胃中粗蛋白質、干物質和有機物的消化率顯著高于牛，酸性洗滌纖維的利用率也更高。水牛獨特的瘤胃微生物系統是水牛在漫長的旱季沒有綠草的情況下比牛長得多的原因，這種降解木質素的能力可能與水牛獨特的瘤胃微生物區系有關。多項研究表明，水牛瘤胃中纖維素分解菌白色瘤胃球菌數量顯著高于肉牛，且稻草飼喂水牛瘤胃中纖維素分解菌、蛋白分解菌和淀粉分解菌總數顯著高于相同飼喂方式。本文假設水牛瘤胃木質素降解菌的能力來源于其獨特的木質素降解酶系統，旨在從基因組學和酶學的角度探討潛在木質素降解菌的降解木質素的能力，本研究結果對水牛降解木質素的機理有一定的指導意義。
研究材料與方法
1.實驗材料：從水牛瘤胃中分離得到一株蠟樣芽孢桿菌（B. cereus）AH7-7。
2.測序平臺： Pacbio Sequel、Illumina Novaseq
3.分析內容：細菌基因組完成圖測序、eggNOG數據庫注釋、KEGG數據庫注釋、碳水化合物酶活性分析（CAZYs）、愈創木酚顯色實驗、木質素降解實驗等。
研究結果
菌株AH7-7的鑒定
形態學實驗顯示該菌菌落很大，呈蠟狀、圓形、半透明和灰白色，表面粗糙，邊緣不規則(圖1A)，顯微鏡下革蘭氏染色顯示為革蘭氏陽性(圖1B)。16S rRNA基因和gyrB基因的系統發育樹顯示，菌株AH7-7與蠟樣芽孢桿菌最接近(圖2)。根據菌落觀察、革蘭氏染色、生理生化數據、16S rRNA測序和gyrB基因測序結果，菌株AH7-7鑒定為B. cereus AH7-7。
圖1 菌株AH7-7形態學鑒定
圖2 16S和gyrB基因進化樹構建分析
蠟樣芽孢桿菌AH7-7的全基因組特征
全基因組測序結果表明，B. cereus AH7-7由一條染色體和一個環狀質粒組成，分別為 5,328,700 bp和461,035 bp；GC含量和基因個數為別為：35.36%、5440個基因，33.67%、455個基因；全基因組圈圖如圖3所示。
表1 B.cereus AH7-7基因組特征
圖3 B. cereus AH7-7基因組圈圖
B.cereus AH7-7的eggNOG、KEGG和CAZYs數據庫注釋
eggNOG數據庫中，染色體基因組中有1個ORF注釋為漆酶基因，1個ORF注釋為多銅氧化酶基因，5個ORF注釋為細胞色素P450基因，8個ORF注釋為單加氧酶基因，30個ORF注釋為雙加氧酶基因，7個ORF注釋為過氧化氫酶基因，36個ORF注釋為氧化酶基因，28個ORF注釋為氧化還原酶基因，109個ORF注釋為脫氫酶基因。在質粒基因組中，1個ORF被注釋為多銅氧化酶基因，1個ORF被注釋為細胞色素P450基因，1個ORF被注釋為氧化還原酶基因，6個ORF被注釋為脫氫酶基因。
表2 eggNOG功能注釋中與木質素降解相關的酶
CAZY數據庫中，總共45 ORF被注解為糖基轉移酶基因，一個ORF多糖裂合酶基因，39個ORF作為碳水化合物的酯酶基因，基因12 ORF輔助活動，12個ORF carbohydrate-binding模塊的基因和40個ORF糖苷水解酶基因(圖4)。如表3所示，兩個ORF注解為香草醛醇氧化酶基因,兩個ORF，4-benzoquinone還原酶基因，三個ORF glucooligosaccharide氧化酶，殼寡糖氧化酶或纖維寡糖脫氫酶基因，三個orf為單加氧酶基因，兩個orf為漆酶或二氫地丁氧化酶基因。
圖4 碳水化合物酶活性注釋結果統計
表3 B.cereus AH7-7輔助活性家族相關基因
在kegg數據庫中，B.cereus AH7-7基因組中有15個基因與苯丙氨酸代謝有關4個與氯環己烷和氯苯降解相關，11個與苯甲酸酯降解有關，7個與細胞色素P450代謝有關，6個與苯乙烯代謝有關；8個降解為萘，1個降解為硝基甲苯，7個降解為氨基苯甲酸酯，4個降解為二甲苯。
圖5 B.cereus AH7-7在芳香降解相關KEGG通路中富集的基因數量
蠟樣芽孢桿菌AH7-7漆酶分泌
愈創木酚培養基對B.cereus AH7-7漆酶分泌量的測定。菌株培養第4天開始出現輕微的紅褐色暈，第10天逐漸加深，第15天顏色發育明顯。
圖6 愈創木酚與硫酸鹽-木質素還原的顯色反應
蠟樣芽孢桿菌AH7-7的硫酸鹽-木質素降解
B.cereus AH7-7降解硫酸鹽-木質素的還原過程如圖7所示，在培養的前兩天，培養基中硫酸鹽木質素含量略有下降。幼仔6 d后，硫酸鹽木質素含量顯著降低(25.9%)。
圖7 硫酸鹽木質素還原圖
研究結論
本研究表明，從水牛瘤胃中分離得到的B.cereusAH7-7具有降解木質素的能力。該菌具有漆酶、細胞色素P450和香蘭素醇氧化酶基因，這些基因可以產生參與木質素降解的酶。B.cereus AH7-7的漆酶分泌量和降解硫酸鹽木質素的能力隨時間增加而增加。
本研究的denovo測序和部分數據分析由上海派森諾生物科技有限公司完成。如需進一步討論，歡迎發郵件或者致電我們喲（郵箱地址：[email protected]，聯系電話：025-56165883-832）！
文章索引：Zhong H, Zhou J, Wang F, et al. Whole-Genome Sequencing Reveals Lignin-Degrading Capacity of a Ligninolytic Bacterium (Bacillus cereus) from Buffalo (Bubalus bubalis) Rumen[J]. Genes, 2022, 13(5): 842.
