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IF 10.588，從miRNA水平研究TDCPP對(duì)生物體壽命影響及作用機(jī)制

2022-05-23

Journal of Hazardous Materials

影響因子：10.588

文章題目：Tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate reduces longevity through a specific microRNA-mediated DAF-16/FoxO in an unconventional insulin/ insulin-like growth factor?1 signaling pathway

發(fā)表期刊：Journal of Hazardous Materials

技術(shù)手段：small RNA-seq

派森諾與上海大學(xué)攜手合作，于近期在Journal of Hazardous Materials 上發(fā)表了TDCPP對(duì)秀麗隱桿線蟲壽命影響及作用機(jī)制的研究成果。

研究背景

作為多溴聯(lián)苯醚的重要替代品，磷酸三（1,3-二氯-2-丙基）酯（TDCPP）在全球多種環(huán)境介質(zhì)中頻繁檢出，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和人體健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，TDCPP具有致癌致畸性、神經(jīng)毒性、發(fā)育毒性、生殖毒性及內(nèi)分泌干擾等毒性效應(yīng)。在此背景下，本研究選取秀麗隱桿線蟲為壽命研究模型，闡述了TDCPP誘導(dǎo)的毒性效應(yīng)及作用分子機(jī)制，系統(tǒng)的研究TDCPP對(duì)生物體壽命影響及作用機(jī)制，采用多學(xué)科交叉方法，運(yùn)用small RNA組學(xué)、生物信息學(xué)等技術(shù)，鑒定了TDCPP降低壽命顯著相關(guān)的靶標(biāo)基因、蛋白及生物標(biāo)志物，探究TDCPP降低壽命的關(guān)鍵信號(hào)通路。

技術(shù)路線

研究結(jié)果

1.TDCPP處理的線蟲Small RNA測(cè)序

為了了解TDCPP脅迫后的壽命調(diào)控機(jī)制，進(jìn)行了小RNA測(cè)序，對(duì)總RNA進(jìn)行質(zhì)檢，構(gòu)建小RNA文庫，經(jīng)過過濾得到了高質(zhì)量小RNA reads（圖1a），利用miRBase數(shù)據(jù)庫對(duì)其進(jìn)行注釋，并對(duì)每個(gè)樣本中的小RNA類型進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)（圖1b），每組大約鑒定到了329-341個(gè)已知的miRNAs，用于后續(xù)的miRNA生物信息學(xué)分析。

圖1

2.已知miRNA的差異表達(dá)分析

利用DESeq軟件，篩到41個(gè)miRNAs顯著差異表達(dá)，其中有20個(gè)上調(diào)的miRNAs以及21個(gè)下調(diào)的miRNAs，并對(duì)這些差異基因做熱圖（圖1c）。然后，使用 miranda 以秀麗線蟲的 mRNA 的 3’UTR序列為目標(biāo)序列，對(duì)差異表達(dá)的 miRNA 序列，進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。共預(yù)測(cè)到了4234個(gè)靶基因，并對(duì)靶基因進(jìn)行了GO和KEGG富集分析，其中GO富集中有3個(gè)條目與壽命有關(guān)（圖2a），KEGG富集中有5個(gè)pathway與線蟲的衰老和壽命有關(guān)（圖2b）。

圖2

3.鑒定非常規(guī)IIS信號(hào)通路中與壽命相關(guān)的miRNAs

統(tǒng)計(jì)了上述結(jié)果中的5個(gè)KEGG 通路上的所有靶基因，通過韋恩圖展現(xiàn)了每個(gè)通路上共有特有的mRNA（圖3a），其中akt-1和akt-2這兩個(gè)基因是5個(gè)通路上共有的靶基因。為了進(jìn)一步探討TDCPP脅迫線蟲壽命下降的機(jī)制和miRNA表達(dá)的變化，研究確定了在非常規(guī)IIS信號(hào)通路有8個(gè)差異表達(dá)的miRNA以及對(duì)應(yīng)的靶基因。其中，一個(gè)重要的編碼長(zhǎng)壽的基因daf-16受3個(gè)miRNA和34個(gè)靶點(diǎn)調(diào)控。圖3B是這8個(gè)差異表達(dá)的miRNAs在火山圖中位置，然后又通過RT-qPCR來驗(yàn)證結(jié)果的可靠性，結(jié)果表明，RT-qPCR結(jié)果與小RNA測(cè)序結(jié)果基本一致(圖3C.3D)。基于這些結(jié)果，利用Cytoscape軟件構(gòu)建了一個(gè)初步的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖(圖4)，該網(wǎng)絡(luò)圖揭示了miRNAs和mRNAs的相互作用關(guān)系，也進(jìn)一步表明了TDCPP降低線蟲壽命的作用機(jī)制。

圖3

圖4

4 .TDCPP 與 cel-miR-48–5p/cel-miR- 84–5p分子對(duì)接

為了更直接表明相互作用，本研究在TDCPP和cel-miR-48-5p/cel-miR-84-5p之間進(jìn)行了分子對(duì)接。通過三維結(jié)構(gòu)、對(duì)接分?jǐn)?shù)和氫鍵都表明cel-miR-48-5p和cel-miR-84-5p與TDCPP有很強(qiáng)的結(jié)合能力，比較直觀的表明了TDCPP脅迫下這兩個(gè)miRNAs參與了線蟲壽命的調(diào)控。

圖5

5. miR-48和miR-84在線蟲壽命系統(tǒng)中的調(diào)控作用

為了進(jìn)一步探討這兩個(gè)miRNA對(duì)壽命的分子調(diào)控機(jī)制，本研究選擇了3個(gè)敲除突變的線蟲樣本，(1)miR-48(N4097)，(2)miR-84(N4037)，(3)雙突變體，并設(shè)立了氮?dú)鈱?duì)照組，評(píng)估了突變組與對(duì)照組在TDCPP(1000μg/L)脅迫后daf-16轉(zhuǎn)錄水平以及線蟲的行為能力、身體發(fā)育和壽命等指標(biāo)（圖6），結(jié)果顯示對(duì)照組中daf-16轉(zhuǎn)錄水平顯著下降，而兩個(gè)突變組的daf-16轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，雙突變組中上調(diào)則更顯著。此外，本研究還探索了下游基因mtl-1的轉(zhuǎn)錄水平，TDCPP脅迫下突變組中mtl-1的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于對(duì)照組。有研究表明mtl-1是DAF-16/FoxO信號(hào)通路的下游靶點(diǎn)，miR-48和miR-84不僅影響daf-16的轉(zhuǎn)錄水平，而且還抑制其下游靶標(biāo)mtl-1的表達(dá)。

圖6

文章小結(jié)

本文通過研究發(fā)現(xiàn)TDCPP脅迫后上調(diào)的miR-48和miR-84(let-7家族成員)不僅抑制DAF-16/FOXO，還抑制其下游靶標(biāo)mtl-1的表達(dá)，進(jìn)而損害線蟲運(yùn)動(dòng)行為，降低壽命。此外，還發(fā)現(xiàn)miR-48和miR-84可能與線蟲的發(fā)育有關(guān)。該結(jié)果有助于更深層次了解TDCPP的毒性效應(yīng)和作用機(jī)理，為構(gòu)建環(huán)境氯代有機(jī)磷酸酯污染的生態(tài)毒理和健康風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警及防控措施提供科學(xué)依據(jù)。

本研究的測(cè)序和數(shù)據(jù)分析工作由上海派森諾生物科技有限公司完成。

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