2022-05-31
期刊：Nucleic Acids Research
影響因子：16.97
近期，派森諾生物與華東理工大學合作，在Nucleic Acids Research上發表了題為《Xenogeneic nucleoid-associated EnrR thwarts H-NS silencing of bacterial virulence with unique DNA binding》的研究成果。文章證實了EnrR是一種能拮抗H-NS的毒力激活劑，并揭示了細菌異種基因調控因子識別和調控外源DNA的獨特機制。
研究背景
移動基因元件(MGEs)的水平基因轉移是影響細菌基因組進化的主要動力。對于革蘭氏陰性細菌病原體，III型和VI型分泌系統(T3/T6SS)以及其他各種毒力決定因素編碼水平在基因組島(GIs)中獲得。在這里，我們鑒定了一種新的調節因子，EnrR，它位于含有MGE相關基因的GI中。EnrR通過在esrB啟動子中與H-NS競爭并抑制其表達來控制T3/T6SS。EnrR以NAP的形式與細菌類核共定位。結構分析顯示EnrR具有獨特的DNA結合模式。
最后，我們證明了EnrR是一個獨特的NAP，發揮了H-NS拮抗毒性激活劑的作用，為研究EnrR識別AT-rich DNA的機制提供了新的思路。
研究路線
研究成果
1、EnrR控制T3/T6SS在體外和體內的表達
為了闡明EnrR在細菌毒力中的作用，我們研究了EnrR對細菌毒力的控制是否與T3/T6SS的表達有關。我們使用抗T3SS蛋白EseB和T6SS蛋白EvpP的血清對T3/T6SS分泌進行Western blot分析，qRT-PCR等實驗進一步證實EnrR正向調控T3/T6SS的產生。接下來，利用活體生物發光成像技術研究了EnrR對大比目魚感染過程中T3/T6SS的調控作用。實驗結果均表明，EnrR控制了感染過程中T3/T6SS的體外和體內表達。
2、EnrR與esrB啟動子中的H-NS競爭，激活毒力基因表達
H-NS抑制愛德華氏菌T6SS基因的轉錄。在這里，我們證實了在wt和enrR突變株中，H-NS過表達抑制T3/T6SS蛋白和EsrB的產生。值得注意的是，H-NS是愛德華氏菌的必需基因，其缺失突變只能由另一個抑制突變產生。研究結果表明，盡管我們不能排除EnrR作為轉錄激活因子的活性，但EnrR在克服H-NS抑制esrB表達方面依然有很大作用。我們進一步研究了在T3/T6SS誘導條件下生長的細胞中H-NS占用對esrB啟動子的影響。結果表明，EnrR 拮抗 H-NS 與 esrB 啟動子區域的結合，減輕 H-NS 對主調節因子 EsrB 的抑制，從而促進毒力基因表達。
3、在體內和體外，EnrR以NAP蛋白與DNA結合為特征
EnrR是一個小的、基礎的(PI=11.4)、高表達的DNA結合蛋白，估計每個細胞約有29000個拷貝，可與H-NS豐度相媲美，并被假設為NAP。為了驗證這一假設，我們做了一系列的實驗。在DNA結合競爭實驗中，EnrR-DNA復合物的數量隨著放線菌素D和甲基綠的濃度的增加而減少，分別是特定的小槽和大槽結合藥物，強烈表明EnrR可以結合DNA小槽和大槽。為了進一步研究該問題，我們做了原子力顯微鏡(AFM)分析、共定位實驗、DAPI染色等實驗，結果進一步證實了EnrR可以廣泛結合到DNA、質粒和類核的不同區域。因此，我們認為EnrR代表了一個新描述的NAP。
4、EnrR靶向于含有富集AT共識序列的DNA區域
ChIP-seq和MST分析評估分析結果顯示，EnrR靶向的DNA片段具有AT富集序列。重疊的ChIP-seq和RNA-seq富集區域/基因廣泛分布在所有GIs對應的低G+C含量區域。qRT-PCR分析證實，EnrR株中GI6、GI11和GI16所選基因的轉錄水平均顯著高于WT株，而在過表達H-NS的enrR/P0456-hns株中，所選基因的轉錄水平均降低至WT水平。
此外，對chip富集DNA序列的統計分析證實，與其他區域相比，EnrR被更密集地招募到A + T含量較高的區域，包括GI區域。以上這些結果表明EnrR是一個全局調控因子，傾向于靶向和抑制水平獲得的外源富含AT基因的表達。
5、EnrR介導DNA相互作用過程中的構象變化
噬菌體λ和cro的抑制子和噬菌體434的抑制子的晶體結構已被報道過。EnrR和這些噬菌體蛋白都含有一個HTH基序。然而，可能由于它們的序列相似性低，EnrR的整體折疊與這些蛋白顯著不同。我們發現，EnrR結合后，DNA1雙鏈嚴重扭曲。除了DNA復合物，我們還解決了EnrR的一個載脂蛋白結構。雖然EnrR的載脂蛋白結構和復合物結構的整體折疊相似，但結構疊加可以揭示EnrR的一些細微構象變化。許多DNA相互作用的殘基在EnrR和NER中是保守的，這表明后者在靶DNA結合方面可能遵循類似的方式。
研究結論
III型和VI型分泌系統(T3/T6SS)編碼于水平獲得基因組島(GIs)中，在細菌病原體的進化和毒性中起著至關重要的作用。T3/T6SS的表達受到宿主異種消音器H-NS的嚴格控制，但如何抵消這一機制尚不清楚。在這里，我們報道了編碼在GI中的異種核相關蛋白EnrR對病原細菌愛德華氏菌和沙門氏菌的毒力至關重要。我們發現EnrR在這些細菌中對T3/T6SS的表達起著關鍵作用。多種生化和遺傳分析表明，EnrR結合并抑制T3/T6SS的關鍵調控因子esrB的啟動子，通過與H-NS競爭促進其表達。
此外，EnrR靶向AT富集區，全局調節約363個基因的表達，并參與各種細胞過程。與特定的AT-rich回文DNA復合的EnrR晶體結構揭示了一種新的DNA結合模式，包括保守的hthp介導的與主槽的相互作用，以及與對稱相關的雙鏈中n端延伸到小槽的接觸。綜上所述，這些數據表明EnrR是一種能拮抗H-NS的毒力激活劑，突出了細菌異種基因調控因子識別和調控外源DNA的獨特機制。
本研究的RNA測序工作由上海派森諾生物科技有限公司完成。
原文索引：
Ruiqing Ma, Yabo Liu, Jianhua Gan, Haoxian Qiao, Jiabao Ma, Yi Zhang, Yifan Bu, Shuai Shao, Yuanxing Zhang, Qiyao Wang, Xenogeneic nucleoid-associated EnrR thwarts H-NS silencing of bacterial virulence with unique DNA binding, Nucleic Acids Research, Volume 50, Issue 7, 22 April 2022, Pages 3777–3798, https://doi.org/10.1093/nar/gkac180
