2022-04-26
期刊：《mSystems》
影響因子：6.496
文章題目：Cultivating Lentinula edodes on Substrate Containing Composted Sawdust Affects the Expression of Carbohydrate and Aromatic Amino Acid Metabolism-Related Genes
發表期刊：mSystems
技術手段：RNA-Seq、標記定量蛋白質組學
派森諾與四川農業大學攜手合作，于近期在《mSystems》上發表關于轉錄組和蛋白質組的聯合分析，研究了堆肥木屑基質對香菇品質的相關基因表達的影響。
研究背景
香菇(Lentinula edodes)具有很高的營養價值和經濟價值，其產量占世界蘑菇產量的五分之一以上。香菇的生長過程是從菌絲結生長到菌絲形成棕色膜、原基和子實體發育。其中，棕褐色菌膜的形成，是香菇生長周期中一個獨特的階段。褐膜的厚度和深度影響著原基的發育和子實體的品質，因此，褐膜的質量決定著香菇能否成功栽培。在香菇的大規模栽培中，木屑仍然是應用比較廣泛的基質。
相關研究表明，適當調整培養基質有利于提高食用菌的潛在營養價值，采用堆肥栽培基質，可減少病原菌數量和雜菌污染。此外，由于木質素、纖維素等有機物的降解，菌絲更容易從堆肥基質中吸收營養物質。然而，堆肥基質在香菇栽培中并不常用，堆肥底物對栽培香菇的其他影響及其分子機制尚未得到系統研究。因此，作者對新鮮和堆肥木屑栽培的香菇進行了研究，重點研究了褐膜形成階段，利用多組學技術分析了RNA和蛋白質水平上酶活性和基因表達的差異。
技術路線
研究結果
1. 堆肥改變了木屑的質量
堆肥使木屑的顏色由棕紅色變為深棕色。木屑堆肥后，纖維素、木質素、半纖維素和有機碳含量顯著降低，總含氮量顯著升高(表1)。香菇菌絲在堆肥木屑上的生長速率更快，堆肥木屑（ND）的多糖含量比新鮮木屑（CK）更高(表1)。此外，ND組的褐膜形成較CK組提前了14天，以上說明木屑堆肥促進了香菇的生長。
表1堆肥木屑（ND）和新鮮木屑（CK）的理化特性
2. 轉錄組數據分析
經過Q20篩選后，每個樣品通過質量過濾的clean reads約為43,000,000 ~ 49,000,000，占香菇褐膜cDNA文庫中原始reads的94%。70%到79%的通過質量篩選后的reads比對到香菇基因組，其中約84%比對成功，超過96%比對到外顯子。基于FPKM, CK和ND的基因表達水平相似(圖1A)，說明數據可以進行后續的差異表達分析。
在注釋到的9455個基因中，編碼假定蛋白、MFS超家族轉運蛋白、細胞色素P450、α/β水解酶、類受體激酶等基因的表達水平比較高。ND與CK相比，有235個差異表達基因(DEGs)，其中96個基因上調，139個基因下調(圖1B)。上調的DEGs包括編碼MFS超家族轉運蛋白、細胞色素P450和絲氨酸蛋白酶抑制劑等基因；下調的DEGs包括編碼胚胎發育晚期豐富(LEA)結構域的蛋白、醛酮還原酶和α/β水解酶的基因。
差異表達基因的功能富集分析中，DEGs富集到441個GO條目。在生物過程類別中，芳香氨基酸家族代謝、生物合成過程和分支酸顯著富集 (圖1C)。在分子功能類別中，富集到內肽酶及肽酶抑制劑、調節酶活性、以及碳氧裂解酶活性等。在細胞成分類別中，一共有61個DEGs被劃分為四種膜成分GO條目中。在KEGG富集分析中，DEGs在苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成途徑等28條代謝通路中顯著富集。
圖1 轉錄組數據分析
3. 差異表達基因的qPCR驗證
通過qPCR檢測18個DEGs的表達水平，9個基因通過RNAseq和qPCR分析的差異豐度標準(表2)，其中細胞膜組分條目的 8個DEGs中有4個，芳香氨基酸家族代謝過程條目中的4個DEGs中有2個，剩下的3個基因都屬于碳水化合物代謝過程條目。
表2 qPCR驗證結果
4. 蛋白組學數據分析
在TMT標記的多肽定量蛋白質組學分析中，在“shiitake”數據庫中鑒定出2509個蛋白和8407個多肽。與CK相比，ND的187個差異表達蛋白中有74個上調，113個下調(圖2)。在GO分析中，差異表達蛋白(DEPs)主要富集到代謝過程、單組分過程、細胞和細胞部分、催化活性和結合(圖3)。
圖2 在含有堆肥木屑(ND)和新鮮木屑(CK)的基質上培養的香菇棕膜的差異表達蛋白
圖3差異表達蛋白的GO富集分析
在KEGG富集分析中，DEPs被分配到74個通路中。蛋白質：XP-007327210.1, XP-007325842.1, XP-007325855.1, XP-007328515.1, XP-007326488.1, XP-007326180.1, XP-007334384.1, XP-0073315491, XP-007332048.1, XP-007325723.1, XP-007325639.1, XP-007325271.1, XP-007326547.1, XP- 007333581.1的連接度最高，是蛋白互作網絡圖中的關鍵蛋白。在這些關鍵蛋白中，除了XP-007325271.1是酰基載體蛋白/NADP泛素氧化還原酶(ACP)外，其余均為假定蛋白。蛋白質XP-007326180.1、XP-007334384.1、XP-007331549.1、XP-007332048.1和XP-007325639.1都直接相互作用(圖4)。
圖4 蛋白互作網絡分析
5. 碳水化合物活性酶分析
在轉錄組測序結果中，注釋為碳水化合物活性酶(CAZymes)的基因占差異表達基因的7.2%。包括1個碳水化合物酯酶(CE)、1個糖基轉移酶(GT)和4個輔助酶(AA)的基因表達上調；5個糖苷水解酶(GH)、3個CE、1個碳水化合物結合模塊(CBM)、1個GT和1個AA基因表達下調(表3)。注釋為CAZymes的蛋白占差異表達蛋白的15.5%。包括3個GH蛋白和1個AA蛋白上調；14個GH蛋白、4個CE蛋白、6個AA蛋白和1個多糖裂解酶(PL)蛋白下調(表3)。
表3 轉錄組中注釋為CAZymes的差異表達基因和蛋白
6. 轉錄組和蛋白組的相關性分析
轉錄組與蛋白質組的Pearson相關系數為0.072。將蛋白質組和轉錄組富集的結果進行比對，發現兩個組的前20條KEGG通路中有7條通路是共有的，分別是氰基氨基酸代謝、磷酸肌醇代謝、戊糖和葡萄糖酸鹽相互轉化、磷脂酰肌醇信號系統、RNA聚合酶、淀粉和蔗糖代謝和酪氨酸代謝途徑(圖5)。在蛋白質組和轉錄組中均檢測到3對差異表達的蛋白和基因。其中，LENED_010224及其對應的蛋白A0A1Q3ELU5、LENED_004417 及其對應的蛋白A0A1Q3E6U4均上調，LENED_009984 (A0A1Q3ELG3)在蛋白組中上調，在轉錄組中下調。在GO分析中，A0A1Q3ELU5和A0A1Q3E6U4被劃分為內肽酶抑制劑活性和氧化還原酶活性條目。KEGG富集分析得到酪氨酸代謝、脂肪酸降解和糖酵解/糖異生3條顯著性高的通路。
圖5 DEGs和DEPs的KEGG分析
7. 酶活性測定
為分析木屑堆肥對木質纖維素降解的影響，測定了香菇棕褐色菌膜木質纖維素降解相關酶活性。結果顯示：果膠裂解酶的活性范圍從5至10 U mL-1，β-葡聚糖酶的活性從10至20 U mL-1，纖維素酶的活性從16至25 U mL-1，錳過氧化物酶、漆酶和木質素過氧化物酶的活性均低于7 U mL-1(圖6)。CK和ND的酶活性沒有統計學差異。
圖6 CK和ND的酶活性測定
文章小結
本文采用轉錄組學和蛋白質組學方法研究了在新鮮(CK)和堆肥(ND)木屑基質上培養的香菇，重點研究了其棕膜形成階段。在以堆肥木屑為生長基質的培養基上，褐膜形成時間較短，菌絲生長速度較快，說明使用堆肥基質可以縮短香菇的培養時間。ND的生長速度快于CK，可能與ND含氮量高有關。在含木屑的堆肥基質上生長的香菇中，大部分注釋于碳水化合物活性酶的差異表達基因被下調，可能與木屑中半纖維素和纖維素含量較低有關。與CK相比，編碼MFS和細胞色素P450的基因在ND中表達上調，表明在這個階段轉運的物質更多。KEGG通路的變化可能與基質中纖維素、半纖維素和氮含量的差異以及在堆肥基質上生長的香菇較高的生長速率和多糖含量有關。
本研究中轉錄組和蛋白組的檢測與數據分析工作由上海派森諾生物科技有限公司完成。
