2022-04-25
《Agronomy-Basel》
影響因子：3.417
派森諾與中國科學院東北地理與農業生態研究所（大豆分子設計與育種重點實驗室）合作，在農學基因組領域《Agronomy-Basel》（影響因子3.417）發表新研究成果！本文利用基于SSR的遺傳圖譜與BSA定位相結合，定位到與大豆兩個農藝性狀（總花莢數(TFPN)和單株有效莢數(PNPP)）相關的基因。
研究背景
大豆(Glycine max (L.) Merrill)是一種重要的種子作物，種子中含有約40%的可食用油和20%的優質蛋白質。該蛋白質包含完整的氨基酸圖譜，包括人類健康所必需的八個氨基酸；廣泛的種植和高產使大豆成為一種可持續作物，以滿足世界范圍內對植物蛋白飲食日益增長的需求。因此，產量一直是大豆改良的主要目標。
產量是一個非常復雜的性狀，它由許多不同的組成部分組成，如單株莢果數(PNPP)、單株莢果種子數和百粒重，其中PNPP是決定大豆產量的一個特別重要的因素，因為它與單株籽粒產量有很強的相關性(r = 0.84)。研究表明，花或豆莢的總數量（TFPN）或兩者都能大大提高大豆產量。因此，了解TFPN和PNPP的遺傳機制將有助于闡明這些性狀對產量的遺傳貢獻，對高產大豆品種的培育具有重要意義。
研究材料與方法
1.實驗材料：以大豆品種JY73和地方品種TJSLH為雜交材料，共得到100株RIL分離群體。
2.測序策略：分別選取兩個極端性狀多花多夾（MFP）與少花少夾（LFP）各30個個體進行混池測序，測序深度為30X。
3.分析內容：基于SSR的遺傳圖譜構建、BSA精細定位分析、候選基因驗證等。
研究結果
1.表型鑒定
親本TJSLH和JY73在TFPN、PNPP、單株種子數和單株產量4個性狀上均存在顯著差異。簡而言之，4個性狀JY73表型值高于TJSLH(圖1)。這些特征之間的相關分析(表1)表明，與PNPP 、TFPN顯示最強的正相關(r = 0.903， p < 0.01)，其次是單株產量和種子數/植物(分別為0.833和0.807，p值< 0.01)。PNPP與單株種子數和單株產量呈顯著正相關(r = 0.868和0.903，p值< 0.01)。這些結果表明，TFPN和PNPP都是大豆產量的重要組成部分，可能有助于大豆的產量的提高。
以1個MFP品種 (JY73) 和1個LFP地方品種 (TJSLH) 作為親本，構建了100個RIL群體，用來對其花莢相關性狀進行QTL定位。四個性狀的表型值分布如圖1所示。在JT種群中，R3期TFPN和R8期PNPP的變化幅度較大，分別為50 ~ 300和10 ~ 160。所有表型值分布范圍均較大，表明這4個性狀都是由多基因定量控制的。此外，所有4個性狀在群體中都觀察到強烈的越界分離，這表明對測量性狀有積極影響的等位基因分布在親本之間。
圖 1. F2 種群中 TFPN (a)、PNPP (b) 和其他兩個農藝性狀 (c,d) 的分布。
表 1 大豆 TFPN、PNPP 與產量相關性狀的相關系數。
2.TFPN和PNPP兩個性狀的QTL定位
基于151個標記(138個ssr標記，13個indel標記)進行遺傳連鎖圖譜的構建，一共得到20個連鎖群，總圖距長度為1351.5 cm，平均圖距為11.5 cm。基于該遺傳圖譜結果進行JT群體花莢數的性狀定位，最終在第2、3、4、7和10連鎖群上共鑒定出6個控制TFPN的QTL位點，在連鎖群2、4、5、7和10上檢測到5個控制PNPP 的QTL位點， (表2、圖2)。其中，qPN2、qPN7和qPN10在Kuroda et al.(2013)和Ning et al.(2018)中也有發現。在Yang et al.，(2013)中檢測到qPN5，這支持了結果。根據不同群體或環境條件下的多個研究，證實了qPN4的穩健表達及其在PNPP中的重要作用。
qPN4對PNPP表型變異的解釋率為9.6%，加性效應值為13.89;它也控制TFPN，命名為qFPN4，占TFPN觀測變異的9.2%，加性效應值為16.81(表2)。因此，qPN4/qFPN4控制了兩個高度相關的性狀:PNPP和TFPN。目前，在這一區間內控制花莢相關性狀的基因尚未在大豆中被報道。
表 2 TFPN 和 PNPP 的 QTL 信息
圖 2. RIL 群體的遺傳圖譜和TFPN和PNPP的QTL。RIL群體的遺傳圖譜和TFPN和PNPP的QTL。
3.基于BSA分析進行候選基因的精細定位
為了探究qFPN4這個區間內是否有關鍵候選基因，利用具有極端表型的TJSLH (NIL-qFPN4) 、 JY73 (NIL-qfpn4)的后代構建遺傳群體進行BSA性狀定位。將來自30個TFPN和PNPP高的個體的DNA混合成為MFP混池。同樣，將30個TFPN和PNPP低的個體DNA混合形成LFP混池。為了找到與性狀相關的關鍵基因，對這兩個混池進行了高通量全基因組測序。測序共獲得33.28 G的原始數據，質控后高質量數據占比為93.44%， MFP和LFP分別有98.34%(208,615,358)和98.67%(213,395,128)的reads比對到參考基因組上。比對上的reads在參考基因組中的平均覆蓋度為95.44%，平均測序深度為26×。
采用ED算法分析MFP和LFP之間顯著SNP/Indel性狀關聯區域。關聯閾值為ED=1.0時，在RHLs確定的qFPN4的物理位置(Chr.4: 41,754,458 - 445,173 bp)，在Chr.4: 39,889,438 - 454,442,849 bp處發現了一個具有顯著信號的基因組區域(圖5)。該區域的變異為候選基因的篩選提供了有用的變異信息。
圖3. ED相關值在4號染色體上的分布。注:彩色點代表每個SNP (a)或Indel (b)的ED值。
4． 候選基因的鑒定與驗證
基于SNP/ indel的BSA分析和QTL定位結果(圖3和圖5)識別了一個約2.62 M的交叉區域，該區域位于Gm04: 41,754,458 - 444,375,173 bp。根據Williams 82這個參考基因組序列可知該區域包含127個基因，其中8個基因在兩個區段之間存在SNP或InDel的非同義突變(表3)。特別是Glyma.04G178900基因上的單堿基插入（C:CT）導致5氨基轉移造成蛋白功能缺乏。
表3在參考Williams82序列中預測qFPN4位點~2.62 Mb區域內的基因。
為了驗證性狀關聯的關鍵基因，從不同發育階段收集的不同組織(包括根、莖、葉、芽、發育中的豆莢和種子)的來探究基因的表達模式。結果顯示在不同組織中有不同的表達模式，其中Glyma.04G176400在莖、葉和子葉中表達量最高，表明Glyma.04G176400在營養生長期起著重要作用。其余基因Glyma.04G176600和Glyma.04G178900在花期(Flower5)和早期莢果(Pod_seed1、Pod_seed2、Pod_seed3、Pod1、Pod2和Pod3)相對于其他組織高度表達(圖6)。這表明這兩個基因可能是參與調控花和莢果發育的關鍵基因。
圖4. 8個基因在不同組織中的表達模式及相對水平。
5.從遺傳變異角度對上述定位基因驗證
對302份具有代表性的大豆品種(包括已測序的野生大豆、地方大豆和栽培品種)進行了遺傳變異分析。如圖5和表4所示，基因型分析顯示了8個候選基因在群體中這些非同義snp或Indels的分布和頻率的差異。這8個基因的等位基因可能在大豆馴化和發育過程中對花和莢數的發育起作用，表明這些基因能夠滿足人類對更高大豆產量的需要。
圖5. 大豆、長白及改良品種中8個基因的等位基因頻率。
表4 群體中8個基因的變異信息和百分比
結論
本研究發現一個與TFPN和PNPP性狀關聯的關鍵QTL且這兩個性狀是由一個單顯性基因控制的，其中qFPN4等位基因控制低TFPN和PNPP，而qfpn4控制高TFPN和PNPP。關鍵QTL-qFPN4是一個~2.62 Mb的區間(Gm04: 41,754,458-44,375,173)。在這一區間內，有8個基因攜帶非同義突變的SNP和/或InDels。根據基因表達模式分析可知Glyma.04G176600和Glyma.04G178900為關鍵候選基因。此外，本研究還開發了一個與該QTL-qFPN4緊密連接的InDel標記C1-5，可以通過標記輔助選擇促進大豆的改良。本研究結果證實了qFPN4對大豆產量的影響，豐富了大豆改良的候選QTL。
文章索引：
Sun, X.; Sun, X.; Pan, X.;Zhang, H.; Wang, Y.; Ren, H.; Wang, F. Identification and Fine Mapping of a Quantitative Trait Locus Controlling the Total Flower and Pod Numbers in Soybean. Agronomy 2022, 12, 790. https://doi.org/10.3390/ agronomy12040790
