2022-04-11
《 Viruses-Basel》
影響因子：5.048
派森諾生物與廣西大學動物科技學院合作，在病毒基因組領域《 Viruses-Basel》發表新研究成果！本研究從豬場污水中分離到一種多價廣譜噬菌體，該噬菌體既能分解腸炎沙門氏菌，又能分解大腸桿菌，宿主范圍廣。通過對噬菌體的生長的條件和基因組測序發現，該菌具有較好的抗菌效果，且沒有耐藥和毒力相關基因。本研究結果表明，該噬菌體對控制沙門氏菌和大腸桿菌具有有效作用。
研究背景
細菌性食品污染是食源性疾病的主要原因，其中沙門氏菌和大腸桿菌是導致食品污染的常見細菌。沙門氏菌感染可引起多種癥狀，包括頭痛、發燒、腹瀉和腹痛；一些特定的大腸桿菌血清型具有致病性，可導致腹瀉、水腫、出血性結腸炎、尿路感染和敗血癥等。物理、化學和生物等方法可用于控制食品中的細菌污染，然而，各種缺陷和不利影響給其應用帶來了挑戰。此外，在過去的幾十年里，抗生素的過度使用導致了沙門氏菌和大腸桿菌在內的細菌的耐藥性增加。因此迫切需要開發新的和有效的方法來控制食品中的沙門氏菌和大腸桿菌污染，以減少食源性疾病的發病率。
基于噬菌體的生物防治方法越來越被認為是減少食品細菌污染的前瞻性策略。與傳統抗菌劑相比，噬菌體具有易于獲得、特異性、對公眾無害和環境友好等優點，許多實驗研究報告了在各種食品中應用噬菌體來控制沙門氏菌和大腸桿菌污染。本研究分離并鑒定了一個名為EP01的多價廣譜噬菌體，測定了該噬菌體的寄主范圍、生物學特性以及在液體肉湯培養基(LB)中對寄主的溶解能力。本研究的主要目的是評估一種多價廣譜噬菌體對兩種不同食物中沙門氏菌和大腸桿菌污染的生物防治效果。
研究材料與方法
1.實驗材料：
（1）使用了76株菌株，包括大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌等；
（2）從廣西南京豬場污水中分離得到6株噬菌體。
2.測序平臺：
Illumina NovaSeq
3.分析內容：
噬菌體基因組測序、毒力基因和耐藥基因預測、系統發育樹構建、（easyfig）比較基因組分析、噬菌體形態學鑒定、宿主范圍鑒定分析等等。
研究結果
1.多價廣譜噬菌體EP01鑒定
從污水中分離到6個噬菌體，分別命名為Tequatrovirus EP01、moigvirus EP02、moigvirus EP03、moigvirus EP04、moigvirus EP05和Felixounavirus EP06(命名為EP01、EP02、EP03、EP04、EP05和EP06)。這些噬菌體在雙層瓊脂平板上的形態干凈明亮，邊緣整齊，表現出典型的溶菌體特征。對噬菌體的宿主譜對76株菌株進行檢驗，發現在這些噬菌體中，EP01可以感染59株大腸桿菌中的31株和4株沙門氏菌中的1株(圖1)。EP01對沙門氏菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和奇異變形桿菌等其他菌種的菌株上表現出較弱的溶解能力。EP01的斑塊表型在不同的宿主上存在差異，如在大腸桿菌宿主菌株上，斑塊清晰透明，直徑不同。
圖1 6株廣譜噬菌體的宿主譜
2.生物學特性分析
平板上觀察到的斑塊形態顯示EP01能夠形成干凈明亮的斑塊，斑塊直徑為3mm。TEM顯示EP01為二十面體形狀，頭部立體對稱，尾部長而收縮；頭部為典型的正多面體形狀，直徑為45.37 nm；尾長約150 nm，尾徑約10 nm。根據國際病毒分類委員會(ICTV)的鑒定，EP01屬Myoviridae科的T4-like病毒屬。
將不同滴度的EP01與宿主菌混合培養4 h，結果顯示，在MOI為0.001時噬菌體滴度最高，其次為1，說明EP01的最優MOI為0.001。一步生長曲線顯示EP01的潛伏期約為20min；噬菌體滴度在50 min內急劇上升，EP01在隨后的120 min內穩定生長，計算其爆裂大小約為216 PFU/CFU。pH穩定性測試中，EP01在pH值4 ~ 10范圍內相對穩定，在強酸或強堿(pH < 4或pH < > 10)條件下，噬菌體滴度顯著下降；此外，當pH值為3或12時，EP01無活性。在熱穩定性測試中，EP01表現出較高的熱容差。
圖 2. 噬菌體 Tequatrovirus EP01 的生物學特性
3.噬菌體 Tequatrovirus EP01 基因組分析
高通量測序發現，EP01基因組長度為165,577 bp，GC含量為35.43%，基因組中未發現與抗生素耐藥性、毒素和毒力因子相關的基因。EP01基因組共預測出257個CDSs，其中118個CDSs(45.91%)被預測為功能蛋白編碼。在118個功能基因中，55個基因負責DNA復制和修復；45個基因參與結構和包裝；8個基因與宿主裂解相關；6個基因參與轉錄調控基因。
圖3. 噬菌體EP01基因組圈圖
基于主要衣殼蛋白序列的系統發育樹分析表明，EP01與腸桿菌噬菌體RB27、RB51和埃希菌噬菌體ECML-134處于同一分支，表示它們屬于Myoviridae, Tequatrovirus屬。EP01 和克雷伯氏菌噬菌體JIPh_Kp122(角病毒)之間共有142個保守蛋白同源(同源性>64%)。EP01與腸桿菌噬菌體RB27 (Tequatrovirus)之間有247個保守蛋白具有廣泛的同源性(同源性>64%)，包括DNA引物酶、尾纖維和衣殼蛋白。
圖4 主要衣殼蛋白序列系統發育樹圖
圖5 不同噬菌體基因組比較圖
4.噬菌體Tequatrovirus EP01對大腸桿菌的生長有抑制作用
實驗結果顯示，EP01能持續抑制所有被測沙門氏菌和大腸桿菌菌株的生長。陽性對照組，所有宿主菌株明顯增加的數量從1 h - 5 h。EP01治療后，在2h后可計數的腸炎沙門氏菌略升高，然后在3-5h的時候相對于對照組明顯降低。在大腸桿菌中也發現了類似的結果，結果表明，在MOI為0.001時，所有檢測的大腸桿菌在噬菌體處理后1 h內均呈緩慢增長趨勢，2 ~ 5 h內達到穩定水平；MOI為1時，大腸桿菌O157:H7、O114:K90 (B90)和O142:K86 (B)的活菌數在1 h內略有增加，2 ~ 5 h后顯著降低到初始水平?？偟膩碚f，EP01的抑菌效果和MOI濃度有關，MOI為1時的抑菌效果優于MOI為0.001時的抑菌效果。
圖6. 噬菌體Tequatrovirus EP01在LB肉湯培養基中對4株致病性分離株的抑制作用
5.噬菌體Tequatrovirus EP01在防治腸炎鏈球菌、大腸桿菌（O157:H7、O114:K90 (B90)、O142:K86 (B)）中的應用
研究結果顯示，抗菌效果與溫度密切相關。在4℃和28℃條件下發現，EP01顯著降低了肉和牛奶中腸炎鏈球菌、大腸桿菌O157：H7和大腸桿菌O142：K86在培養4、6、24 h后的活菌數。在受污染的肉和牛奶中，EP01可使大腸桿菌O114：K90的活菌數降至初始水平：在肉類中，在MOIs為0.001和1時添加EP01，4℃和28℃培養6h和24h后活菌數顯著降低；4℃培養環境中，在牛奶中，在MOI為0.001時，EP01處理在培養6h和24h后其活菌數顯著降低；在MOI為1時，培養4、6、24h后其活菌數也顯著減少；在28℃培養環境中，MOI為0.001和1時添加EP01，培養4、6、24h后，觀察到的活菌數顯著降低。
圖7. 噬菌體Tequatrovirus EP01對不同食品中細菌活性的抑菌作用
結論
1.從豬場污水中分離得到一株多價廣譜噬菌體EP01，該噬菌體既能分解腸炎沙門氏菌，又能分解大腸桿菌，宿主范圍廣；
2.生物學特性實驗表面，EP01在不同溫度和pH水平下相對穩定，無耐藥基因和毒力基因，比較安全；
3.電鏡觀察和基因組序列分析發現該噬菌體屬于Myoviridae家族下的T4-like屬，且該噬菌體基因組中無耐藥基因和毒力基因，比較安全；
4.EP01還能抑制沙門氏菌和大腸桿菌在LB肉湯、肉和牛奶中的生長；
本實驗表明，多價廣譜噬菌體具有控制食源性病原菌的潛力，可作為食品工業中天然的生物防治替代物。
文章索引：
Zhou, Y.; Li, L.; Han, K.; Wang, L.; Cao, Y.; Ma, D.; Wang, X. A Polyvalent Broad-Spectrum Escherichia Phage Tequatrovirus EP01 Capable of Controlling Salmonella and Escherichia coli Contamination in Foods. Viruses 2022, 14, 286. https://doi.org/10.3390/v14020286
