2022-03-28
期刊：《Microorganisms》
影響因子：4.087
派森諾與華中農業大學動物醫學院合作，在微生物基因組領域的《Microorganisms》發表新研究成果！本研究檢測了九種腸道沙門氏菌亞種，分離出毒性最強的腸炎鏈球菌211（SE211）。本研究首次獲得腸球菌高毒力分離株SE211完整基因組序列，并對其進行比較基因組學和系統發育分析，為進一步研究腸球菌遺傳學提供了初步的認識。
研究背景
沙門氏菌是一種廣泛存在的人畜共患病病原體，通過受感染的牲畜和家禽引起人類食物中毒，沙門氏菌病例是全球細菌性食源性疾病最常見的原因之一，在世界范圍內造成了巨大的經濟損失。沙門氏菌是一個高度多樣化的屬，包括兩個物種（邦戈里沙門氏菌和腸道沙門氏菌），其中腸道沙門氏菌被認為是最具致病性的物種。在分類學方面，一方面，腸道沙門氏菌可分為六個亞種，并有2600多個血清型。另一方面，根據沙門氏菌引起的人類疾病，沙門氏菌主要分為兩類：傷寒沙門氏菌血清型和非傷寒沙門氏菌（NTS）血清型。
近年來，隨著抗生素試劑的廣泛應用，沙門氏菌的耐藥問題日益突出。特別是沙門氏菌的耐藥菌株在一些發展中國家造成了相當大的經濟損失，甚至是造成人類死亡。因此研究沙門氏菌潛在的毒力機制，并積極開發有效的治療方法，對解決其致病性具有重要意義。雖然鼠傷寒沙門氏菌的治病機制已被研究，但許多其他腸道沙門氏菌的致病性仍不清楚。本研究分離得到9株沙門氏菌，通過全基因組測序和比較基因組分析揭示其毒性機制，深入了解該菌基因組中潛在的致病機制。
研究材料與方法
1.實驗材料：從雞腸中分離得到9株腸道沙門氏菌分離物，選擇毒性最強的菌株SE211進行高通量測序。
2.測序平臺：Illumina NovaSeq、PacBio Sequel
3.分析內容：細菌完成圖測序、毒力基因預測、ANI分析、比較基因組圈圖、進化樹構建、MLST、qPCR實驗等。
研究結果
致病性分析及關鍵毒力基因表達
根據圖1A所示實驗設計進行急性感染實驗，檢測九種分離株的毒力表型、細胞入侵和生物被膜，結果表明：分離菌株SE211具有強毒力表型（對雞的致死率為80%，細胞入侵率高，生物膜形成中等），這與其體內毒力基因spvB、avrA、bcfC和rck高表達一致。因此，本文認為SE211的毒力機制可能高度激活，并與其高致死性和細胞入侵能力（多種毒力特征）相關，因此它可能是闡明潛在致病機制的良好模式菌株。
圖1九株腸氏沙門分離菌株的基本毒力特征
SE211基因組一般特征分析
基于上述體外內研究，SE211更傾向于在遺傳水平上表現出毒力機制。SE211的基因組由一條染色體和一個含有兩個復制子的毒力質粒組成。通過MLST分型法，SE211被鑒定為ST11。SE211染色體的基因組長度為4679414 bp，質粒長度為59372 bp，預測的ORF分別為4418個和86個，GC含量分別為52.17%和51.94%。在染色體基因組中，約9.1%的全基因組長度（491個基因）預測出為基因組島區域；4418個ORF中的193個基因被預測為致病菌的毒力因子。
表1 SE211基因組基本信息
可移動基因元件分析
對于SE211菌株分析chr區域被稱為SPI的毒力相關GIs的結構和主要功能。而對于毒力質粒blast分析表明其與RST的S1:A-：B22的不相容性（Inc）類型F相匹配；該質粒中含有編碼關鍵毒力因子的基因，以及大量已知毒力相關基因和一個未知功能性毒力基因（vsdF），且毒力基因兩側是一些整合移動基因元件（IMGE）。這些存在于細菌基因組中的溶原性噬菌體和移動基因元件（MGE）可能編碼CRISPR-Cas系統的抑制基因，稱為抗CRISPRs。有趣的是，由于HGT事件可能有助于毒力因子的轉移和抗生素耐藥性的發展，抗CRISPR可能會影響細菌的發病機制。
圖2 SE211基因組中沙門氏菌致病島（SPI）和質粒的基因組分析
比較基因組分析
基于ANI分析得到SE211與四種食源性腸炎沙門氏菌株最為相似。系統發育樹表明這些菌株的聚類關系與其血清型一致，值得注意的是，SE211聚集在兩種食源性菌株（P125109和EC20121179）附近。特別是P125109是一種人類食物中毒腸炎鏈球菌菌株，最初在英國分離，可追溯到一個家禽養殖場。該樹還揭示了腸炎鏈球菌、雞鏈球菌和鼠傷寒鏈球菌血清型的高度遺傳異質性。
圖3 12種沙門氏菌基因組比較和聚類分析
全基因組測序和分析
使用從NCBI下載的12株腸道沙門氏菌菌株（11株腸道沙門氏菌，包括SE211和亞利桑那州沙門氏菌）和243株腸炎沙門氏菌基因組來執行基于cgMLST的MST圖。共分成九個MST集群，SE211屬于MST集群2。除SE211外，從腹瀉患者中分離的兩株腸炎沙門氏菌SE104和SE109以及一株從臨床分離的菌株也包括在該群中。SE211腸炎沙門氏菌與其他血清型菌株之間的距離很遠，而與11個選定菌株的基因組相似，這歸因于它們相同的生物學特性和進化環境。
圖4 255份腸道沙門氏菌基因組樣本的最小生成樹（MST）圖
研究結論
1.全基因組測序進行的基因型分析可用于了解致病機制，包括與暴發相關的菌株的毒力、耐藥性和分子進化；
2.基因組SE211編碼許多毒力因子，尤其是位于含有毒力質粒、31個GIs和五個原噬菌體區域的MGE中；重要的是，這些MGE伴隨著整合酶和轉座酶等IMGE；
3.在SE211的基因組中發現了一個完整的CRISPR-Cas系統，這可能有助于提高其毒力；
4.鄰接樹和MST在這些基因組中顯示出明顯的距離；
綜上所述，分析腸炎沙門氏菌的遺傳和表型特征可以提高對致病機制和系統發育的理解，從而為預防和治療腸道沙門氏菌感染制定新策略。
本研究的denovo測序和部分數據分析由上海派森諾生物科技有限公司完成。如需進一步討論，歡迎發郵件或者致電我們喲（郵箱地址：[email protected]，聯系電話：025-58185663-836）！
文章索引：Cui LJ, Wang XR, Zhao Y, et al. (2021). Virulence Comparison of Salmonella enterica Subsp. Enterica Isolates from Chicken and Whole Genome Analysis of the High Virulent Strain S. Enteritidis 211. Microorganisms.doi.org/10.3390/microorganisms9112239.
