2022-03-22
《Frontiers in Pharmacology》
影響因子：5.81
文章題目：Protective Property of Scutellarin Against Liver Injury Induced by Carbon Tetrachloride in Mice
技術手段：LC-MS非靶，16S多樣性組成譜，轉錄組
派森諾與大理大學攜手合作，于近期在《Frontiers in Pharmacology》上發表了燈盞花素對四氯化碳誘導小鼠肝損傷保護作用的研究成果。
研究路線
藥物濫用和過度飲酒都可引起肝損傷，并引發一系列病理生理過程，進而導致肝脂肪變性、肝炎和肝纖維化等。由肝損傷引起的肝病造成了巨大的經濟負擔，并引起全世界的廣泛關注。然而，目前仍沒有有效的治療方法。
菊科飛蓬屬植物短亭飛蓬（Erigeron breviscapus）是中國的民族藥，主要分布在云南。燈盞花全草可食用，在云南已被用作功能性草本茶。此外，燈盞花全草在民間醫學中應用于腦栓塞、蛛網膜炎、偏癱、冠狀動脈疾病的治療已有數百年的歷史。燈盞花的主要活性提取物是黃酮類化合物燈盞花素(scutellarin, SCU)，具有肝保護作用。然而，SCU改善肝損傷的機制直到最近才為人所知。
值得注意的是，SCU的生物藥效率非常低。隨著16S多樣性組成譜測序的出現和無菌模型的開發，研究人員已經認識到腸道菌群對臨床疾病的重大影響。目前，許多生物藥效率低的植物營養素已被證明通過重塑腸道菌群發揮藥理作用，例如提高益生菌的相對豐度。因此，腸道菌群可能是SCU影響肝臟的機制之一。
本研究中，我們通過轉錄組學分析確定了SCU修飾的肝臟信號通路，結果顯示nf-κb和cyp2e1基因的表達明顯降低。然后基于16S多樣性組成譜測序進行分類分析，以確定與SCU肝保護作用相關的特定屬，并觀察到SCU處理后乳酸桿菌顯著富集。最后，我們利用LC-MS/MS進行非靶向代謝組學分析，探討SCU改善CCl4誘導的肝損傷的潛在機制。這些數據表明，從功能性食品中提取的SCU似乎是一種很有效的保護肝臟免受損傷的藥物。
研究結果
?1.SCU的肝保護作用
轉錄組學分析表明，與對照組相比，SCU組的肝臟轉錄組發生了顯著變化(圖1A,B)。細胞炎癥反應的主要調節因子nf-κb基因被顯著抑制。此外，我們還觀察到cyp2e1基因，一種調節酒精、乙酰氨基酚和CCl4代謝的毒理學蛋白，在SCU處理組被抑制(圖1C)。KEGG富集分析顯示，SCU處理后，30條信號通路發生顯著變化，并揭示了一個參與抗炎反應和藥物代謝的調控網絡(圖1D)。綜上所述，SCU對肝臟炎癥反應有顯著影響，并表現出肝保護作用。
圖1 SCU的肝保護功能
?2.SCU對CCl4誘導的小鼠肝損傷的保護作用
我們嘗試在CCl4誘導的哺乳動物模型中評估SCU的肝保護作用。如圖2A-C所示，CCl4組血清AST、ALT和TBIL水平顯著升高，而SCU組則顯著降低。六個組的血清白蛋白水平沒有明顯差異(圖2D)。與這些結果一致的是，CCl4處理的小鼠出現了大量的小葉中心壞死、炎性細胞浸潤和肝細胞凋亡，而SCU處理組的肝損傷明顯減輕(圖2E,F)。
圖2 SCU對CCl4誘導的小鼠肝損傷的保護作用
?3.SCU抑制CCl4肝毒性小鼠的CYP2E1和NF-κB
接下來，我們嘗試在CCl4肝毒性小鼠模型中證實SCU的肝保護作用與CYP2E1和NF-κB有關。CCl4主要經肝臟CYP2E1代謝產生自由基，自由基可引發氧化應激并間接誘導炎癥反應。CCl4刺激顯著提高了肝臟CYP2E1的表達(圖3A-C)，導致肝臟MDA升高(圖3D)，SOD降低(圖3E)。SCU處理后CYP2E1介導的氧化應激得到明顯改善(圖3A-E)。CCl4還可以直接刺激炎癥反應。NF-κB是調節炎癥基因表達的關鍵轉錄因子，在炎癥反應中發揮關鍵作用。基于圖1C的結果，NFκB也是SCU的潛在靶點。為了驗證上述結果，我們檢測了IκBα和NF-κB在肝臟中的表達。CCl4中毒可顯著下調IκBα和NF-κB的胞質表達，上調核NFκ b的表達。SCU以劑量依賴的方式顯著抑制IκBα/NF-κB信號通路(圖3F)。IL-6、IL-1β和TNF-α是受κBα/NF-κB信號通路調節的關鍵炎性細胞因子。為了證實IκBα/NF-κB信號通路的抑制是這三種炎性細胞因子減少的結果，我們檢測了肝臟中IL-6、IL-1β和TNF-α的表達。與對照組比較，CCl4組大鼠肝臟IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA水平明顯升高，而在SCU處理組顯著降低 (圖3G)。
圖3 SCU抑制CCl4肝毒性小鼠的CYP2E1和NF-κB
?4.SCU調節腸道菌群
腸道菌群是生物藥效率低的植物營養素發揮藥理作用的關鍵輔助因素。綜上所述，在CCl4肝損傷模型中，高劑量SCU組(0.12 mmol/kg)具有較好的肝保護作用；我們對對照組、CCl4組和高劑量SCU組糞便樣品中的腸道菌群進行分析。本研究采用Chao1、Shannon和Pielou指數來評價腸道菌群的豐富度、多樣性和均勻度。CCl4刺激顯著提高了三項指標，SCU處理后恢復(圖4A)。PcoA分析顯示對照、CCl4和SCU組的菌群聚類可以明顯的區分(圖4B)。此外，我們還分析了細菌在門水平上的分類相似性程度，以評估對照組、CCl4組和SCU組的整體腸道菌群組成的變化(圖4C)。CCl4組擬桿菌門/厚壁菌門比值顯著升高，SCU組擬桿菌門/厚壁菌門比值降低(圖4D)。Z-score分析進一步用于確定CCl4和SCU處理后改變的特定屬(圖4E)。與對照組相比，CCl4組的乳酸桿菌、雙歧桿菌和阿克曼菌的相對豐度明顯降低。SCU處理則顯著提高了這些屬的相對豐度(圖4F)。Spearman相關性分析顯示，三個屬中只有乳酸菌與肝損傷指標SOD、AST、IL-6、IL-1β、TNF-α、NF-κB、CYP2E1呈現正相關或負相關(圖4G)。基于KEGG數據庫的PICRUSt分析發現，SCU處理后，脂質代謝、輔助因子和維生素代謝、復制與修復代謝通路得以恢復(圖4H)。
圖4 SCU調節腸道菌群
?5.SCU處理后的代謝譜分析
對糞便和肝臟組織采用非靶向代謝組學分析進一步評價SCU對CCl4誘導肝損傷的改善作用。PCA和OPLS-DA顯示對照組、CCl4模型組和SCU處理組之間可以明顯區分。置換檢驗圖顯示未發生過擬合，實驗結果可靠。
根據VIP>1和p<0.05的標準篩選差異代謝產物。在糞便樣本中，我們發現了7種與亞油酸代謝和不飽和脂肪酸生物合成有關的差異代謝物(表1,2)；在肝臟組織樣本中，我們發現了11種與視黃醇代謝相關的差異代謝物(表3,4)。
結論
綜上所述，SCU通過抑制CYP2E1和IκBα/NF-κB信號通路，調節腸道菌群，富集乳酸菌，調節參與脂質代謝和膽汁酸穩態的內源性代謝物，從而對CCl4誘導的肝損傷產生明顯的保護作用。我們的研究表明，SCU是開發治療肝損傷功能性食品的潛在候選藥物。
本研究的16S多樣性組成譜測序和LC-MS非靶向代謝組學檢測均由上海派森諾生物科技有限公司完成。
