2022-03-09
《Journal of Agricultural and Food Chemistry》
影響因子：5.279
文章題目：Protective Effect of LTheanine against DSS-Induced Colitis by Regulating the Lipid Metabolism and Reducing Inflammation via the NF-κB Signaling Pathway
發(fā)表期刊：Journal of Agricultural and Food Chemistry
技術手段：RNA-Seq、脂質代謝組學
派森諾生物與湖南農業(yè)大學攜手合作，于近期在《Journal of Agricultural and Food Chemistry》上發(fā)表關于茶氨酸通過調節(jié)脂質代謝和減少炎癥來在DSS引起的結腸炎中發(fā)揮保護作用的研究成果。
研究背景
炎癥性腸病(IBD)與結腸慢性炎癥有關， IBD的發(fā)病機制復雜，與遺傳易感性、微生物失調和環(huán)境因素有關。盡管其病因尚不清楚，但腸道屏障的破壞和持續(xù)的炎癥已被證實是重要的原因。持續(xù)的炎癥可通過脂質代謝失調而加重腸道損傷。然而，脂質代謝異常與炎癥性腸病發(fā)病機制的相關性仍有待進一步研究。此外，IBD的傳統(tǒng)治療方法一直使用5-氨基水楊酸、糖皮質激素或免疫調節(jié)劑，其耐藥性引起廣泛關注。因此，迫切需要開發(fā)新的安全治療方法來控制長期炎癥，且不產生嚴重的副作用。
茶氨酸（L-theanine）是茶葉中的活性物質之一，由于其具有廣泛的生物活性，因此被廣泛用作食品添加劑，且無嚴重副作用。許多研究表明，茶氨酸很容易被生物利用，并且在腸道中很快被吸收，它對大腦、胃和肝臟的炎癥損傷有保護作用。然而，茶氨酸治療腸道炎癥的潛力尚未得到充分研究，特別是從脂質代謝的角度。本研究揭示了茶氨酸對DSS誘導的結腸炎的保護作用及機制，突出了其對炎癥和腸道屏障的調節(jié)作用。此外，還進行了轉錄組學和脂質代謝學分析，以揭示茶氨酸對DSS誘導的結腸炎小鼠結腸代謝的調節(jié)作用。
技術路線
研究結果
1. 茶氨酸處理可改善DSS誘導的結腸炎
如圖1B所示，與CON組相比，DSS組小鼠的體重明顯下降，而茶氨酸組小鼠的體重逐漸增加，尤其是在處理第7天和第8天。第8天的體重降低趨勢與體重的趨勢相同(圖1C)。茶氨酸處理后，結腸長度顯著恢復，DSS處理后結腸長度明顯縮短(圖1D、F、G)。然而，DSS和茶氨酸對結腸重量沒有顯著影響(圖1E)。此外，DSS誘導的小鼠DAI評分升高，茶氨酸顯著逆轉了這一趨勢(圖1H)。
圖1 茶氨酸改善DSS誘導小鼠結腸炎的進展
2. 茶氨酸處理可改善結腸黏膜炎癥
如圖2A、B所示，DSS組炎癥浸潤和上皮損傷的組織學評分高于CON組，而LTD組明顯改變了這一趨勢。為評價茶氨酸的抗炎作用，測定了小鼠血清和結腸組織中細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。可以觀察到，DSS顯著提高了血清和結腸組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平，而茶氨酸顯著降低了這些促炎細胞因子的水平(圖2C-F)。DSS顯著提高COX2和iNOS的表達水平，茶氨酸能夠使COX2和iNOS的表達水平顯著降低(圖2G)。而TLR2和TLR4表達水平無顯著影響(圖2G)。
圖2 茶氨酸處理可改善結腸組織的粘膜炎癥
3. 茶氨酸處理可改善結腸炎組織的腸道屏障功能
如圖3A、B所示，與CON組相比，DSS組ki67陽性細胞數(shù)量較低，而茶氨酸顯著增加。相反，TUNEL染色顯示DSS處理組的小鼠有大量腸道死亡細胞，但茶氨酸處理顯著減少了結腸中TUNEL陽性細胞(圖3C、D)。腸緊密連接相關mRNA的表達結果如圖3E所示。結果顯示，DSS顯著降低了結腸組織Occludin、Claudin1和Ecadherin的表達水平，而茶氨酸緩解了這些變化。
4. 茶氨酸處理可下調DSS誘導急性結腸炎的NF-κB信號通路
Western blot檢測NF-κB和AKT信號通路相關蛋白的表達，進一步探討茶氨酸的作用機制。如圖4所示，DSS顯著提高了p65、p-p65、p53、p-p53和p-AKT的表達水平，而茶氨酸則降低了這些趨勢。但AKT蛋白表達水平在四組間無差異。
圖4 茶氨酸下調DSS誘導急性結腸炎的NF-κB信號通路
5. 茶氨酸改變了結腸炎小鼠模型的轉錄譜
層次聚類分析結果顯示CON、L-T、DSS和LTD組的轉錄譜顯著不同(圖5A)。此外，根據(jù)p值篩選出的前20個GO富集結果如圖5B、C所示，在兩種比較組中 (DSS組vs CON組，LTD組vs DSS組)，GO條目的數(shù)量在分子功能類別中最多。同時，大多數(shù)富集GO條目與炎癥相關(圖5B、C)。KEGG代謝途徑分析顯示，DSS處理主要影響炎癥途徑，包括炎癥性腸病(IBD)(圖5D)。我們發(fā)現(xiàn)DSS處理顯著影響“細胞因子-細胞因子受體相互作用”通路，被認為是對炎癥具有關鍵作用，茶氨酸也顯著影響了這一途徑(圖5D、E)。此外，在LTD組與DSS組比較的KEGG通路富集結果中，發(fā)現(xiàn)了脂質代謝相關通路(圖5E)。
圖5 茶氨酸改變了結腸炎模型的轉錄譜
與CON組相比，DSS組有108個上調差異表達基因，8個下調差異表達基因。而LTD組與DSS組相比，有22個上調差異表達基因，1個下調差異表達基因。在這些基因中，差異表達前30的基因如圖6A、B所示。此外，分析和驗證了與細胞增殖、脂質代謝過程和炎癥相關的基因。這些基因表達水平與轉錄組數(shù)據(jù)一致(圖6C、D)。這些結果表明，茶氨酸可以改變結腸炎模型的轉錄譜。
圖6 茶氨酸改變了結腸炎模型的轉錄譜
6. 茶氨酸處理改變結腸炎小鼠模型的脂質譜
為了探索結腸組織脂質代謝產物，采用LC - MS對其進行檢測分析。結果表明，CON組、L-T組、DSS組和LTD組的脂質組代謝產物顯著不同。層次聚類分析和PCA分析結果顯示，與DSS組相比，LTD組的脂質組代謝產物與L-T和CON組相對更接近(圖7A、B)。說明DSS處理引起結腸組織脂質代謝紊亂，而茶氨酸通過逆轉作用發(fā)揮了保護作用。與CON組相比，DSS組的甘油三酯(TG)和磷脂酰膽堿(PC)是鑒定最多的脂類(圖7C)。這些結果表明，DSS處理通過改變結腸脂質譜引起脂質代謝紊亂，而茶氨酸通過逆轉作用發(fā)揮了保護作用。
圖7 茶氨酸處理改變結腸炎模型的脂質譜
7. 轉錄組學和代謝組學聯(lián)合分析
在轉錄譜中，我們選擇了與細胞增殖、脂質代謝過程和炎癥相關的基因進行分析驗證，如圖6C、D所示。與CON組相比，DSS處理顯著影響了51種脂質代謝產物。最豐富的脂類分類是磷脂酰乙醇胺(PE)和PC。此外，Cxcl3、Gchf r、Areg和Timp1基因屬于炎癥反應，與差異脂質代謝物幾乎顯著相關(圖8A)。同時，茶氨酸主要影響PC和Cer，其次是MePC、PE和SM鑒定的脂類。相關基因為Gbp10和Pnlip，分別屬于炎癥反應和脂質代謝過程(圖8B)。這些結果表明，茶氨酸可能主要通過炎癥反應相關途徑逆轉結腸炎模型的轉錄譜和脂質譜。
圖8 轉錄組和代謝組之間的相關性
文章小結
本研究揭示了茶氨酸對DSS誘導的結腸炎小鼠模型的改善作用。結果表明，3% DSS處理顯著誘導了腸損傷，表現(xiàn)為疾病活動指數(shù)（DAI）、組織病理學特征和結腸長度等特征，而茶氨酸預處理顯著阻止這些趨勢。同時，茶氨酸預處理可降低DSS誘導的結腸炎組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS和COX2的水平。值得注意的是，DSS抑制了腸上皮細胞的增殖，促進了腸上皮細胞的凋亡，從而破壞了腸上皮屏障的完整性，而茶氨酸起到了保護作用，減輕了這些惡化所帶來的影響。
茶氨酸可下調急性DSS誘導結腸炎患者p-p65、p65、p-p53、p53和p-AKT蛋白的表達，表明茶氨酸主要通過NF-κB信號通路發(fā)揮保護作用。此外，脂質分析和轉錄組分析結果表明，茶氨酸逆轉了結腸炎小鼠模型的轉錄譜和脂質譜，主要通過炎癥反應相關通路。有趣的是，轉錄譜和脂質譜之間的相關性分析表明，炎癥反應相關基因與差異脂質代謝產物幾乎顯著相關?？傊?，茶氨酸通過下調NF-κB信號通路，調節(jié)脂質代謝紊亂，在DSS誘導的結腸炎中發(fā)揮保護作用。
