2022-03-08
《Journal of Advanced Research》
影響因子：10.479
派森諾與浙江理工大學植物次生代謝創新團隊許玲老師課題組合作在國際知名期刊《Journal of Advanced Research》在線發表了題為“Insights into the plateau adaptation of Salvia castanea by comparative genomic and WGCNA analyses”的研究論文。該研究首次通過比較基因組分析揭示了栗色鼠尾草的起源與進化，闡明了栗色鼠尾草在1600萬年前青藏高原形成過程中，與栽培丹參開始了物種的分化；并通過RNA-seq和WGCNA分析闡明了栗色鼠尾草高原適應性的機理。
研究背景
鼠尾草是一種野生植物，適應青藏高原（QTP）極端環境。由于富含丹參酮 IIA (T-IIA)成分，鼠尾草也被用于藥用。盡管它對中藥工業很重要，但該物種中次生代謝物（即 T-IIA 和迷迭香酸 (RA)）積累相關的機制、以及鼠尾草特殊地下組織在QTP 適應中的作用機制仍然未知。本文通過探索鼠尾草地下莖中心的類周皮結構現象，揭示該物種QTP適應的分子進化機制，為后續栽培丹參的遺傳改良提供重要參考。
研究材料與方法
實驗材料
2020 年 11 月采集于中國云南省麗江市玉龍雪山地區的一年生和多年生鼠尾草野生樣品。1979年至2020年的氣象資料來自于靠近采樣點的玉龍納西族自治縣。對于物種進化和高次生代謝物積累的分析，將樣品分成不同的組織（根、莖、葉和葉柄），立即將其浸入液氮中進行進一步的 PacBio SMRT 測序分析。收集一年生和多年生植物的葉、周皮、韌皮部和木質部組織，共收集八種組織用于二代測序和活性成分分析，三個生物重復。
測序平臺
Illumina NovaSeq、PacBio SMRT
分析內容
對栗屬植物進行形態學觀察和全長轉錄組研究。鼠尾草與其他14個代表性物種的比較基因組分析用于揭示其系統發育位置和分子進化機制。應用RNA-seq和WGCNA分析來了解鼠尾草組織中T-IIA和RA高積累的機制。
研究結果
R1：形態學和地下莖特殊發育模式
本研究中使用的鼠尾草種生長于玉龍山區，長橢圓形葉基生，上下表面密被絨毛。在開花季節，四邊形莖會從基生葉和開花的鼠尾草輪枝上抽薹，花的上唇也有濃密的絨毛。這些特點對高原環境的適應做出了很大貢獻。有趣的是，而該物種的地下形態很特殊，因為樹木的多枝收縮并埋在地下，根據形態外觀，很難區分地下莖和主根。然而，從一年生根的橫截面可以清楚地看到地下莖的自下而上的分化，其中心部分逐漸分裂，生成周皮樣組織，包圍新生成的組織，在地下莖中間留下中空結構。在發育過程中，中心部分徑向分成幾個對稱的小“分支”，具有獨立的木質部結構。周皮可能作為一層外衣或盔甲，緊緊圍繞著新生成的樹枝狀結構，并隨著地下莖的發育而不斷再生。石蠟斷面散開較多細枝狀結構，地下莖自下而上分化。因此，本研究首次提出了“地下樹干--樹枝發育模型”，該模型很好地解釋了栗色鼠尾草地下莖內部周皮樣組織的成因。
圖1：鼠尾草地下莖的形態特征及發育模型
R2：比較基因組學分析
基于鼠尾草以及公共數據庫下載的14個代表性植物基因組，利用比較基因組學分析共確定了212個單拷貝OGG用于物種系統發育樹構建。結果表明鼠尾草是丹參的近源，大約在1600萬年前與丹參分離。擴張與收縮分析發現栗色鼠尾草在植物干細胞CLV-WUS逆反饋回路上擁有LRR結構域等直系同源基因群的特異性擴增，并鑒定出24個特有基因，尤其是2個細胞程序性死亡基因；有趣的是，特有OGG的GO分析顯示：韌皮部或木質部組織發生、韌皮部枝條發育只在收縮的5750個OGG涉及。因此，收縮的OGG可能有助于鼠尾草形成特定的地下莖結構。
同時還篩選出具有特殊DNA損傷修復、抗氧化等功能的64個正選擇基因，其中3種與PSG相關的氧化還原酶活性和3種與PSG相關的磷酸酶活性對于調節 ROS 至關重要。這些結果表明，鼠尾草中的PSG（PAC和CHLM）復雜的調控網絡，共同實現了栗色鼠尾草獨特的地下莖形態以適應高原強紫外線、低氧、低溫等極端特殊生境。
圖2：比較基因組分析的鼠尾草系統發育及其 QTP 適應機制
R3：地下莖形成的潛在機制與參與鼠尾草的 QTP 適應的基因
RNA-seq分析發現鼠尾草CLV-WUS逆反饋回路上WOX8基因的穩定表達對維持其干細胞穩態利于特殊地下莖形態的形成發揮了關鍵作用。此外植物激素如負責生長素運輸的PIN1A基因在木質部中顯著上調；ABA 信號通路中 ANXD1基因在根組織中被誘導；獨腳金內酯相關基因（MAX1）和根發育相關基因（PMTT和REV1）在木質部中高表達，表明它們在調節地下莖形態發生中的關鍵作用。基于此本文提出了一個CLV-WUS 負反饋環和植物激素生長素所揭示的復雜的網絡來調節鼠尾草地下莖的形態發生。
此外47個絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）在8個組織中大多都高表達；冷適應相關基因RCI2A1和RCI2A2在多年生周皮、韌皮部和木質部組織中顯著上調；DNA損傷修復相關基因DR100a和DR100b在葉中均被抑制。因此，上述結果表明鼠尾草的QTP適應受一個復雜的網絡調節，包括 MAPK 信號轉導、冷適應反應、DNA 損傷修復和泛素化過程。
圖3：鼠尾草地下莖發育和高原適應關鍵基因的表達譜分析
R4：參與丹參酮生物合成的基因
四種丹參酮主要分布在地下組織中，周皮部含量均顯著高于其他組織。大多數與鼠尾草中丹參酮生物合成途徑（MVA和MEP）相關的基因都高度表達。四種丹參酮共有相關的103 個基因中有63個TF基因，其中WRKY家族的成員數最多，都與丹參酮含量呈負相關。通過WGCNA分析共確定了29個模塊，黑色模塊（454 個基因）顯示出最強的相關性，其中有五個hub基因與丹參酮生物合成相關。同時，篩選到5個關鍵TF（如WRK75，HSFB3等)，與調節丹參酮生物合成的其他基因相互作用。
圖4：鼠尾草丹參高丹參酮積累的機制
R5：參與迷迭香酸生物合成的基因
一年生葉中的迷迭香酸（RA）含量達到90.94 mg g-1，顯著高于其他組織。多年生植株中葉片中的SAB 最高。RNA-seq表明多個基因在鼠尾草RA生物合成途徑的每一步中都高表達。苯丙氨酸解氨酶 (PAL) 是RA代謝途徑的第一個酶，對15個物種中的PAL基因的系統發育分析表明鼠尾草中PAL基因的數量與丹參中的一致，表明丹參和鼠尾草的PAL基因可能在進化上是保守的，在物種分化后仍發揮著相似的作用。WGCNA分析確定261個基因與 RA 的積累顯著相關，其中55個基因是TF基因，且大多數TF與 RA 積累呈正相關；只有61個基因與SAB積累顯著相關。通過以上分析實現了該植物中次生代謝物質丹參酮和迷迭香酸的高積累，為后續栽培丹參的遺傳改良提供重要參考。
圖5：栗色鼠尾草中高RA積累的機制
研究結論
鼠尾草是一種生長在QTP上的野生資源。本文組裝了該物種的高質量全長轉錄組，并揭示它從16 Mya左右的中國模式藥用植物丹參中分支出來。基于解剖學觀察，我們提出了“樹干-分枝”發育模型來解釋鼠尾草地下莖中心的周皮樣結構。在進化過程中，直系同源基因組顯著擴大，24個物種特異性基因和64個正選擇基因有助于鼠尾草的形態發生和QTP適應。RNA-seq和WGCNA分析了鼠尾草中兩種次生代謝物(T-IIA和RA)高積累的潛在機制，并將 NAC29和 TGA22 確定為關鍵轉錄因子。總體而言，鼠尾草特殊的地下莖結構和次生代謝提供了對QTP適應機制的深入了解，并進一步為栽培丹參的遺傳改良提供了一些候選基因。
