2022-02-22
《Veterinary Microbiology》
影響因子：3.293
近日，派森諾與廣西大學(xué)合作，在獸醫(yī)微生物領(lǐng)域的《Veterinary Microbiology》發(fā)表新研究成果！在本研究中分離并鑒定了一種新的多價噬菌體SaP7，其能感染多藥的沙門氏菌S7和大腸桿菌；基因組測序、模型試驗、藥敏實驗等一系列結(jié)果表明，該噬菌體與幾種β-內(nèi)酰胺類抗生素存在拮抗作用，故充分和謹(jǐn)慎地評估噬菌體/抗生素的相互作用和可能的結(jié)果是至關(guān)重要的。
研究背景
抗生素具有耐藥性，特別是多藥耐藥性（MDR），是一個日益嚴(yán)峻的全球挑戰(zhàn)。MDR細(xì)菌在人類和動物中經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)，對人類健康已經(jīng)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。就沙門氏菌而言，自20世紀(jì)60年代初首次報道抗生素耐藥性以來，全世界分離出對一種或多種抗生素耐藥的沙門氏菌血清型的頻率不斷增加。事實上，沙門氏菌仍然是導(dǎo)致死亡的主要食源性細(xì)菌之一，因此迫切需要對耐多藥沙門氏菌采取抗生素以外的治療方法，其中噬菌體療法被認(rèn)為是治療多藥細(xì)菌感染的一種替代策略。然而，細(xì)菌往往容易對噬菌體產(chǎn)生耐藥性，就像它們對抗生素產(chǎn)生耐藥性一樣，這極大地限制了噬菌體治療的實際效果。其中，抗生素與噬菌體的組合不當(dāng)?shù)脑挄a(chǎn)生拮抗作用，進(jìn)而降低治療效果。然而，關(guān)于萘啶酸對噬菌體的拮抗作用的研究在很多年前就有報道，但是噬菌體與其他抗生素之間的拮抗作用則鮮有報道。本研究旨在體外檢測SaP7噬菌體（分離和鑒定得到的多價噬菌體）與幾種抗生素的相互作用，以及SaP7聯(lián)合抗生素對仔豬和小鼠沙門氏菌感染的治療作用。
研究材料與方法
2.實驗材料：南寧某豬場污水中分離到噬菌體SaP7
3.測序平臺： Illumina HiSeq
4.分析內(nèi)容：噬菌體全基因組測序、毒力基因和抗生素抗性基因預(yù)測、共線性分析、系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建、藥敏實驗、噬菌體宿主范圍鑒定實驗、動物模型實驗、組織病理學(xué)研究等等。
研究結(jié)果
從南寧某豬場污水中分離到噬菌體SaP7，該噬菌體在宿主中產(chǎn)生直徑0.5-1mm的噬菌斑，該斑塊邊緣整齊、無暈環(huán)。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，該噬菌體是一個二十面體形狀，具有立體對稱的頭部和一個長而收縮的尾巴。噬菌體衣殼直徑118±2nm，尾長200±2nm。噬菌體SaP7根據(jù)系統(tǒng)(ICTV)屬于Myoviridae家族。對沙門氏菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、奇異變形桿菌和銅綠假單胞菌等46株菌進(jìn)行噬菌體SaP7感染活性檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該噬菌體對4株沙門氏菌和35株大腸桿菌分別有1株和7株的空斑，結(jié)果表明噬菌體SaP7是一種多價噬菌體。
圖1 噬菌體SaP7的形態(tài)和生物學(xué)特性
噬菌體SaP7基因組分析
SaP7的DNA雙鏈基因組長度為240,613 bp, GC含量為48.41%。共預(yù)測得到254個ORF，其中63個ORF(24.8%)預(yù)測編碼功能蛋白。與毒力相關(guān)的基因、毒素、抗生素抗性基因組在基因組中均未檢測到，暗示SaP7被用于噬菌體療法的安全性。主要衣殼蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，噬菌體SaP7與沙門氏菌噬菌體SPN3US 、沙門氏菌噬菌體STsAS、沙門氏菌體SPAsTU 、變形桿菌噬菌體7 大腸桿菌噬菌體vB_EcoM_EC001和腸桿菌噬菌體SEGD1處于同一分支。結(jié)果表明，噬菌體SaP7可能屬于 Caudovirales目、Myoviridae科、Seoulvirus屬。
圖2 SaP7噬菌體基因組圈圖和噬菌體衣殼蛋白基因系統(tǒng)進(jìn)化樹
將噬菌體SaP7的基因組與其他感染 Caudovirales目特定宿主的噬菌體的基因組進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)噬菌體SaP7與沙門氏菌噬菌體SPN3US (JN641803.1)的同源性最高(96.51%)；與Erwinia噬菌體Wellington，Erwinia噬菌體vB_EamM_EarlPhillipIV 和Cronobacter噬菌體CR5沒有的同源性。這表明噬菌體SaP7是Seoulvirus病毒屬的新成員。
圖3：五種噬菌體全基因組共線性分析
噬菌體SaP7與β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合治療在體內(nèi)對抗沙門氏菌S7感染的相互作用
為探討噬菌體SaP7和抗生素聯(lián)合使用的抑菌效果是否優(yōu)于單一抗生素或噬菌體，分別用SaP7-AMC、SaP7和AMC治療沙門氏菌S7菌株感染的仔豬。結(jié)果發(fā)現(xiàn)仔豬糞便內(nèi)容物中SaP7和AMC處理組的細(xì)菌載量均明顯低于未處理組，但令人意外的是，與SaP7和AMC單獨處理組相比，SaP7-AMC處理組的治療效果較差，原因是其細(xì)菌載量較高；與糞便細(xì)菌負(fù)荷一致，在脾臟、十二指腸、空腸、回腸、盲腸和結(jié)腸等不同組織中，聯(lián)合處理組的細(xì)菌負(fù)荷均高于噬菌體或AMC單一處理組；對不同治療組的脾臟進(jìn)行組織病理學(xué)分析，以評估組織損傷的程度；與陰性對照組相比，其他四組均出現(xiàn)明顯充血和病變。其中，無治療組充血最明顯，但SaP7-AMC組淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯減少，充血較SaP7單藥組和AMC單藥組更為明顯。
圖4：噬菌體SaP7與β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合治療仔豬沙門氏菌感染的療效觀察
為了進(jìn)一步研究噬菌體SaP7與抗生素之間的拮抗作用，對s7感染小鼠進(jìn)行了SaP7和AMX聯(lián)合治療。結(jié)果發(fā)現(xiàn)模擬感染組小鼠全部存活，而無治療組的存活率僅為14.29%；AMX和噬菌體SaP7單獨處理的小鼠存活率分別為71.43%和85.71%；SaP7-AMX聯(lián)合治療小鼠的存活率為42.86%，遠(yuǎn)低于SaP7或AMX單獨治療小鼠的存活率。存活小鼠在治療后24h和7d也檢測到脾臟的細(xì)菌負(fù)荷。SaP7和AMX單獨處理組的細(xì)菌負(fù)荷均低于SaP7-AMX聯(lián)合處理組，表明噬菌體SaP7在仔豬和小鼠體內(nèi)對AMC和AMX均有拮抗作用。
圖5 噬菌體SaP7與β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合治療BALB/c小鼠(AMX、阿莫西林)沙門氏菌感染的療效觀察
噬菌體SaP7與β-內(nèi)酰胺類抗生素的體外相互作用
β-內(nèi)酰胺類抗生素抑制噬菌體SaP7斑塊的形成
為探討sub-MIC-β-內(nèi)酰胺類抗生素對噬菌體SaP7裂解活性的影響，采用單點試驗檢測了SaP7與阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸鉀和頭孢吡肟1/2MIC聯(lián)合治療時噬菌體斑塊的形成情況。如圖所示，在快速生長寄主的區(qū)域上，僅對噬菌體sap7進(jìn)行處理，觀察到4個清晰的斑塊。而噬菌體SaP7與1/2MIC阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸鉀和頭孢吡肟同時處理含有目標(biāo)菌株草坪的雙層瓊脂板時，卻看不到斑塊。結(jié)果表明，1/2MIC的阿莫西林或阿莫西林/克拉維酸鉀均抑制了噬菌體SaP7的裂解活性。
圖6 噬菌體SaP7與β-內(nèi)酰胺類抗生素的體外相互作用
噬菌體SaP7降低了細(xì)菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性
為評價噬菌體SaP7是否影響沙門氏菌S7對β內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性，分別檢測了3種不同β-內(nèi)酰胺類抗生素(阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸鉀和頭孢吡肟)與SaP7共作用時的MIC。MIC測定結(jié)果顯示，與無噬菌體對照相比，在噬菌體SaP7存在時，阿莫西林和阿莫西林/克拉維酸鉀的MIC分別提高了2倍和8倍。更具體地說，阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸鉀和頭孢吡肟的MIC分別從512μg/mL、256μg/mL和16μg/mL增加到128μg/mL。結(jié)果表明，噬菌體SaP7可降低沙門氏菌S7對β-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性。
拮抗作用不能阻止高滴度噬菌體或高濃度抗生素的抑菌作用
為研究噬菌體SaP7與β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合應(yīng)用是否能改變其抑菌效果，測定了不同MIC濃度的β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合或不聯(lián)合應(yīng)用噬菌體SaP7時宿主菌S7在MH肉湯中的生長曲線。1/2MIC AMX和1/2MICAMC均負(fù)面改變了噬菌體SaP7裂解效果；噬菌體SaP7干擾1/2MIC AMC的抑菌細(xì)菌聯(lián)用組的密度明顯高于單用1/2 MIC AMC組；頭孢吡肟幾乎不能改變噬菌體SaP7的裂解效果；此外，噬菌體SaP7與3種抗生素之間的負(fù)相互作用似乎很弱；上述結(jié)果表明，噬菌體與3種抗生素之間存在拮抗作用，但不能阻止高滴度噬菌體或高濃度抗生素的抑菌作用。
圖7 噬菌體SaP7與β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合治療對沙門菌S7生長的影響
噬菌體與抗生素之間的相互作用是復(fù)雜的，且不同于細(xì)菌和抗生素的種類。
由于SaP7是一種多價噬菌體，測試了噬菌體和抗生素聯(lián)合使用對兩種大腸桿菌宿主菌株(H6和E3)的抑菌效果。H6和E3在6h迅速對噬菌體SaP7產(chǎn)生抗性，11 h后不再降低細(xì)菌密度。首先，噬菌體SaP7 AMX和聚全氟乙丙烯對大腸桿菌的抑菌作用減少到H6,盡管這種影響沒有在AMC中觀察到；其次,一半劑量MIC聚全氟乙丙烯似乎很少影響到噬菌體2 - 9 H和稍微增加了抑菌大腸桿菌噬菌體的E3 12到16小時；而有趣的是，噬菌體SaP7嚴(yán)重影響抑菌1和2的MIC聚全氟乙丙烯，這是符合大腸桿菌代替的結(jié)果。第三,SaP7增加1/2MIC AMX的抑菌作用和1/2MIC AMC大腸桿菌E3與沙門氏菌S7相反，與大腸桿菌H6不同。
圖8 噬菌體SaP7與β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合治療對大腸桿菌H6和e.c oli E3生長的影響
研究結(jié)論
1.Seoulvirus噬菌體SaP7是一種可以控制沙門氏菌和大腸桿菌的多價噬菌體；
2.噬菌體SaP7與3種β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合治療對肉湯中沙門氏菌的生長均有負(fù)干擾作用；
3.噬菌體SaP7與兩種β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)用對感染沙門氏菌的仔豬和BALB/c小鼠均有拮抗作用；
綜上所述，本研究提供了一種新型多價噬菌體SaP7與β-內(nèi)酰胺類抗生素之間拮抗相互作用的證據(jù)，此發(fā)現(xiàn)可以用來告知臨床醫(yī)生在噬菌體和抗生素協(xié)同試驗中可能出現(xiàn)的拮抗作用。
本研究的denovo測序和部分?jǐn)?shù)據(jù)分析由上海派森諾生物科技有限公司完成。
