2022-01-26
期刊：《Aquatic Toxicology》
影響因子：4.96
技術手段：RNA-Seq、LC-MS代謝組學
派森諾生物與西北大學攜手合作，于近期在《Aquatic Toxicology》上發表關于羊角月牙藻經過泰樂菌素處理后的轉錄組學和代謝組學聯合分析的相關研究成果。
研究背景
泰樂菌素(TYN)是一種常用的大環內酯類抗生素，可有效對抗革蘭氏陽性菌，并可作為獸藥用于預防腸道和呼吸道感染。TYN殘留物可以通過在農田中施用糞肥和瀉湖廢水進入環境，值得注意的是，全球地表水中已檢測到濃度高達3.06 μg L-1的TYN。已有研究表明，TYN對藻類的生長和發育產生不利影響。TYN能夠抑制銅綠微囊藻和羊角月牙藻的葉綠素合成，進而抑制其光合作用。此外，TYN降低了銅綠微囊藻和羊角月牙藻的生長性能和增殖能力。
羊角月牙藻是經濟合作與發展組織(OECD)推薦的生態毒理試驗模式藻類，因為它分布全球，生長迅速，對有毒物質敏感。此外，已經完成了羊角月牙藻全基因組測序，并研究了暴露在抗生素中的分子機制。在本研究中，我們利用轉錄組和代謝組的綜合分析來揭示TYN暴露下羊角月牙藻生長抑制的潛在分子機制。本研究發現，在TYN脅迫下，羊角月牙藻生長抑制與光合作用、DNA復制和能量代謝相關的分子通路失調有關。
技術路線
研究結果
1. TYN對羊角月牙藻生長的影響
在本研究中，以3μg L-1（低處理組）和400μg L-1（高處理組）濃度的TYN處理羊角月牙藻7天(圖1)。處理4天后，高TYN處理組的羊角月牙藻相比于對照組減少了67.8%。處理7天后，低處理組和高處理組的生長均受到顯著抑制，相比于對照組分別減少了26.3%和58.3%。
圖1 不同濃度TYN處理7天后的羊角月牙藻生長曲線
2.差異表達基因
相關分析表明，各處理組重復間具有良好的一致性，各處理組3個重復中基因表達的相關系數均大于0.99(圖2A)。值得注意的是，相同處理組的重復樣本在PCA中有很好的聚類，其中PC1和PC2分別解釋了93%和4%的變異(圖2B)。與相關分析和PCA的結果一致，heatmap顯示低TYN處理和對照的基因表達模式非常相似，但與高TYN處理的基因表達模式有明顯的不同(圖2C)。與對照組相比，低、高TYN處理組分別檢測到上調差異表達基因329、2383個，下調差異表達基因248、3055個（圖2D）。
圖2 不同濃度的TYN處理后，羊角月牙藻的轉錄組分析
3.GO、KEGG富集分析
在GO分析中，低、高TYN處理組分別富集了720和3095個GO條目。KEGG代謝途徑分析顯示，在低TYN處理組，DNA復制、同源重組和光合作用等8條途徑受到顯著影響；相比之下，高TYN處理組發生改變的15條通路中，主要為光合天線蛋白、DNA復制、脂肪酸生物合成、光合生物體固碳和光合作用等（表1）。
表1 TYN處理后，各處理組與對照組相比顯著富集的代謝通路
4.代謝組學分析
在正離子和負離子模式下分別檢測出355和415個代謝物。與對照組相比，在負離子模式下，低、高處理組分別鑒定出57和84個差異代謝物；在正離子模式下，低、高處理組分別鑒定出40和94個差異代謝物。
對所有差異代謝物合并進行KEGG富集分析表明，低、高處理組分別富集到5個和6個顯著差異代謝通路。在兩個處理組中代謝途徑，次生代謝物的生物合成，細菌分泌系統和光合作用都顯著富集。
5.轉錄組學和代謝組學聯合分析
對轉錄本和代謝產物的綜合分析表明，與對照組相比，低、高處理組共發現18個和52個差異代謝物與至少一個轉錄本配對（表2）。例如，在低TYN處理組中，差異代謝物及其相關基因腺苷(cmpk1)、磷酸(ap1_2)、腺苷酸(E3.1.3.5)、棉子糖(E2.4.1.82)等在嘧啶代謝、嘌呤代謝、半乳糖代謝等通路中均有相同的上下表達趨勢。而在高TYN處理組中，磷酸(metK)、丙酮酸(ppdK)、乙酰輔酶a (dld)、尿嘧啶(psuG)等在半胱氨酸和蛋氨酸代謝、光合生物體固碳作用、檸檬酸循環、嘧啶代謝等代謝通路中表達趨勢相同。
表2 處理組中差異代謝物與相應轉錄本的關聯
討論
本研究揭示了TYN對羊角月牙藻的毒性分子機制。與我們的假設一致的是，在低和高TYN處理組中，TYN顯著改變了與DNA復制、光合作用和能量生產相關的分子通路。在TYN及其衍生物的長期脅迫下，暴露于TYN下的藻類生長抑制可能是由于光合作用抑制、誘導氧化應激、DNA復制耦合修復增加和能量代謝失調等原因導致的。
1.藻類在TYN脅迫下解毒的相關基因
在藻類中，外源性化合物代謝包括生物轉化(階段I和階段II)和運輸(階段III)。在本研究中，TYN處理后，參與這三個解毒階段的基因在羊角月牙藻中大多下調。在I期，細胞色素P450 (Cyt P450)在低TYN和高TYN處理組均下調；此外，乙醇脫氫酶(adhs)、醛脫氫酶(aldhs)和短鏈脫氫酶(sdrs)僅在高TYN處理組下調。這些結果表明，高TYN處理組的解毒過程可能受到抑制。本研究中，低TYN處理組ABC轉運蛋白家族A、G基因表達顯著上調，而在高TYN處理組中顯著下調。因此，在低TYN處理組中，這些基因的上調可能有助于TYN從藻類細胞中消除，降低TYN暴露引起的毒性;然而，在暴露于高水平TYN處理組中，這些基因的下調顯著抑制了羊角月牙藻的生長。
2.與光合作用相關的分子途徑
本研究中，高TYN處理組中光合作用天線蛋白、卟啉和葉綠素代謝以及光合生物的碳固定等信號通路受到顯著影響。在低TYN和高TYN處理組中，光合作用信號通路均發生了顯著變化。這些結果表明，高水平的TYN處理可能抑制了藻類葉綠素的生物合成和光采集信號。由于TYN誘導的光合抑制，活性氧(ROS)的過度產生可能導致氧化應激和生長抑制。參與C4循環過程的基因(ppc, got2, gpt, E1.1.1.39)下調，表明本研究中，在高TYN脅迫下，CO2的釋放可能減少。在低和高TYN處理組中，丙酮酸、磷酸和ATP含量在代謝水平下降，海藻生長受到抑制。
3.與DNA復制耦合修復相關的分子途徑
在本研究中，參與DNA復制過程的20個DEGs在高TYN處理組中持續下調，這一生物學過程可能是TYN導致藻類生長性能下降的原因(表1)。這些被下調的DEGs編碼的蛋白質參與了DNA復制的不同階段。編碼核糖核酸酶H2的rnaseh2a和rnaseh2c的下調表明DNA復制的終止信號被抑制（表1）。DNA復制耦合修復的抑制可能導致細胞分裂的減少，DNA損傷的積累，以及潛在的基因組不穩定，這表明羊角月牙藻在高TYN處理組的生長性能下降。此外，代謝組學水平上ATP含量的降低可能與TYN脅迫下羊角月牙藻的DNA復制和修復有關。
4.與能量代謝相關的分子途徑
本研究中，高TYN處理組的半乳糖代謝、糖酵解等碳水化合物代謝相關通路受到顯著影響(表1)。在代謝水平上，兩組TYN處理組的檸檬酸、正磷酸和ATP含量均明顯下降。相比之下，高TYN處理組中烏頭酸、丙酮酸和蔗糖含量降低，乙酰輔酶a含量增加。蔗糖、丙酮酸、檸檬酸和ATP含量的降低，暗示了烴類代謝的失調和能量生產的減少，從而導致藻類生長受到抑制。乙酰輔酶a作為烴類代謝和脂類代謝之間的關鍵中間體，進入檸檬酸循環并被氧化生成能量。因此，丙二酰輔酶a的積累表明，在高TYN處理組中，TCA循環的阻塞或脂肪酸氧化的增加。脂質代謝的失調可能導致ROS的過度產生、氧化應激的誘導和藻類生長的抑制。
文章小結
3μg L-1和400μg L-1的TYN影響了羊角月牙藻光合作用、DNA復制耦合修復和能量代謝相關的分子途徑。與TYN在細菌中的作用模式（TYN與50S核糖體結合，抑制蛋白質合成）相反，光合作用信號通路是TYN對于羊角月牙藻毒性最敏感的靶點之一。而在高TYN處理中，生長抑制與光合系統、DNA復制耦合修復、烴類代謝、脂質代謝和氧化應激相關的分子途徑有關。值得注意的是，即使在環境中濃度較低的情況下，TYN的持續存在也可能對初級生產者(如藻類)和食物鏈中較高營養水平的消費者造成不良影響。
本研究中轉錄組和代謝組的檢測與數據分析以及轉錄組、代謝組聯合分析工作由上海派森諾生物科技有限公司完成。
