2022-01-19
期刊：《Journal of Hazardous Materials》
影響因子：10.588
文章題目：Comparative transcriptome analysis reveals the differential response to cadmium stress of two Pleurotus fungi: Pleurotus cornucopiae and Pleurotus ostreatus
技術手段：RNA-seq， RT-qPCR
派森諾生物與四川大學攜手合作，在《Journal of Hazardous Materials》上發表姬菇和平菇對鎘脅迫響應的轉錄組比較的研究成果。
研究背景
鎘(Cd) 作為一種常見的重金屬，被認為是一種生態風險，從而引起了廣泛的關注。研究降低生態系統特別是耕地Cd風險，是目前所迫切需要的。真菌修復是一種基于大型真菌的生物積累和生物降解來消除環境中的污染物的生物修復技術。側耳屬對重金屬的真菌修復有非常大的潛力，然而，關于大型真菌特別是側耳菌對重金屬的耐受和積累的分子機制的知識仍然非常有限。因此本研究以非常受歡迎的食用真菌平菇和姬菇為模型，研究了大型真菌對Cd脅迫的響應機制。
研究內容
對鎘脅迫的反應和鎘的去除能力
培養7d后，通過測定培養液pH、菌絲體DW(生物量)、Cd去除效率和Cd積累量，對不同Cd脅迫條件下姬菇和平菇進行評價。在不同Cd處理(CK: 0mg/L、0.5:0.5mg/L、1:1.0mg/L、5.0mg/L、10:10.0mg/L、20:20.0mg/L)下，培養基pH均無顯著差異（圖1A）。當Cd濃度為0.5mg/L時，兩種菇的生物量均略有增加，高Cd脅迫下平菇和姬菇的生物量均顯著下降(圖1B)。如圖1C所示，隨著Cd的增加，姬菇對Cd去除持續升高，平菇的去除率則以不同的方式增加。同時，隨著環境中Cd濃度的增加，兩種真菌細胞內Cd的含量都增加（圖1D）。
圖1不同Cd處理下的pH值(A)，生物量(B)， Cd去除率(C)和Cd濃度(D)
選擇0、1.0和20mg/L的Cd處理來研究Cd的毒性(圖2)。與生物量相似，20mg/L的Cd處理顯著降低了菌絲球的大小，而CK和Cd1的菌絲大小沒有顯著差異。此外，SEM圖像顯示，Cd處理后菌絲表面無宏觀結構差異，說明Cd不會觸發真菌細胞壁的結構轉變。EDXMA結果證實了Cd存在于菌絲表面，表明Cd由菌絲積累。
圖2 形態學上的毒力效果 A：cd處理后的掃描電鏡；B：切片采用能量色散x射線能譜(EDX)分析，在Cd處理下菌絲表面檢測到微量Cd
轉錄組測序及差異分析
對原始數據過濾后進行拼接，平菇得到166,175條轉錄本和46,684條unigene，姬菇組裝得到1668,731條轉錄本和47,267 條unigenes，并對unigene進行功能注釋。通過zscore標準化表達值分別繪制平菇和姬菇的聚類熱圖（圖3）。通過差異分析結果表明，與平菇相比，姬菇對Cd脅迫更為敏感，從而限制了其金屬積累能力。平菇的基因表達變異低于姬菇，這意味著平菇可以積累和耐受更多的Cd。分析不同Cd濃度下的基因表達差異，平菇中的差異表達基因數目遠高于姬菇，分別鑒定出12551個和708個DEGs。對于姬菇和平菇，1mg/LCd處理下的DEGs少于20mg/L，這可能導致了CK和1 mg/LCd處理之間的生物量差異不顯著(圖1B)。
圖3 基因聚類熱圖
差異基因GO富集分析與Cd轉運途徑的差異
GO富集分析結果（圖4）表明，通過BP類別結果發現，菌絲的代謝和活性受到Cd的影響。在CC類別的結果則表明Cd對姬菇的細胞膜或細胞結構具有一定的破壞作用。尤其是平菇，它可以啟動多種途徑來抵消這種破壞性影響。而在MF類別中，平菇的“催化活性”比姬菇更豐富，說明平菇能夠產生更多的抗氧化劑來清除細胞內ROS，保護細胞免受重金屬脅迫。
Cd轉運相關基因在Cd積累過程中發揮重要作用。通過關鍵基因的差異表達情況，尤其是與ABC轉運體相關的135個內吞和吞噬體相關基因在平菇顯著過表達，這意味著Cd在平菇中的轉運是通過一個更復雜的過程進行的，該過程涉及轉運蛋白而不是ABC轉運蛋白。
圖4 差異基因GO富集分析
關鍵基因的分析、討論及qpcr驗證
隨后本研究深入討論了與Cd耐受相關基因的差異表達，通過SOD、POD和CAT等活性檢測驗證轉錄組結果。結果發現，這兩個物種在基因轉錄和酶活性上的差異表明了它們不同的毒性反應策略。在高Cd脅迫下，平菇的抗氧化酶活性顯著高于姬菇，表明平菇能夠耐受較高的Cd脅迫。通過分析MAPK信號通路在姬菇和平菇中的差異表達，結果表明：1)Cd可導致姬菇細胞壁受損，而平菇細胞壁不受Cd的影響；2)多個過表達的MAPK通路關鍵酶基因可幫助平菇適應Cd脅迫。隨機選取8個高表達的基因進行RT-qPCR分析，驗證RNA測序表達數據的準確性（圖5）。
圖5 RT-qPCR驗證8個基因在平菇和姬菇中的表達
研究結論
在低水平Cd脅迫(≤1mg/L)下，姬菇和平菇均未受到生理和轉錄水平的影響，而在高水平Cd脅迫(20mg/L)下則發生嚴重的抑制和表達差異。盡管系統發育關系密切，但兩種蘑菇對Cd脅迫的響應機制存在顯著差異。MAPK信號通路在兩種真菌中似乎介導了Cd的解毒作用，而過氧化物酶體途徑在平菇中可能作為planB。這些結果為Cd污染水和土壤的真菌修復提供了重要線索，不僅填補了真菌在轉錄組水平上的生物學響應的空白，而且可以指導以環境修復為目的的生物反應器的選擇。
本研究的RNA測序和數據分析工作由上海派森諾生物科技有限公司完成。
