2022-01-19
期刊：《Microorganisms》
影響因子：4.274
派森諾生物與華中農業大學合作，在微生物領域 《Microorganisms》發表研究成果！本研究提供了沙門氏菌的毒力表型和基因組特征，為進一步了解腸道沙門氏菌的毒力機制提供了依據。本研究首次獲得腸球菌高毒力分離株SE211完整基因組序列，并對其進行比較基因組學和系統發育分析，為進一步研究腸球菌遺傳學提供了初步的認識。
研究背景
沙門氏菌是一種廣泛存在的人畜共患病病原體，通過受感染的牲畜和家禽引起人類食物中毒，并在世界范圍內造成了相當大的經濟損失。沙門氏菌病例是全球細菌性食源性疾病比較常見的原因之一，沙門氏菌是一個高度多樣化的屬，包括兩個物種(邦戈里沙門氏菌和薩爾姆沙門氏菌其中，腸道沙門氏菌被認為是最致病的一種。由于抗生素試劑的廣泛使用，沙門氏菌的耐藥性是近年來的一個挑戰。特別是，沙門氏菌的耐藥菌株已經造成了相當大的經濟損失，甚至在一些發展中國家的人類死亡。因此，研究沙門氏菌的潛在毒力機制并積極解決其致病性具有重要意義。
研究材料與方法
1.實驗材料：
從雞體內分離出9株腸鏈球菌(Enteritidis 201、Enteritidis 211、鼠傷寒桿菌206、鼠傷寒桿菌114、鼠傷寒桿菌64、鼠傷寒桿菌62、鼠傷寒桿菌92、Anatum 76和S. Indiana 94?，F儲存于華中農業大學農業部食品安全評價重點實驗室/獸藥殘留國家參比實驗室。鼠傷寒桿菌CVCC541參照株為強毒株，購于中國獸醫培養物保藏庫。
2.測序平臺：
Illumina Miseq 、Pacific Biosciences
3.分析內容：
細菌完成圖測序、系統發育分析和ANI分析、基因家族構建與共線性分析、生物防治分析等。
研究結果
1. 致病性分析及關鍵毒力基因的表達
根據圖1A所示的程序，對9株腸鏈球菌進行了雞的急性感染。四株腸鏈球菌(201、114、64和206)導致雞 5天內死亡，而雞感染了其他五個分離株(211、62、92、76和94)所有幸存下來情緒低落或腹瀉癥狀。接下來，研究人員通過肌肉注射對這些存活的雞進行繼發感染。結果201例患者1周死亡率為100%，211例患者1周死亡率為80%。此外，菌株206、114、64和62也有40%的死亡率，而在相同劑量下，菌株92、76和94對雞沒有致命性(圖1B)。
在每株腸鏈球菌中觀察到不同程度的細胞黏附和侵襲(圖1C)。與CVCC541相比，菌株211、114、64、92、76和94對RAW264.7的總粘附和侵襲量(total)均顯著增加，其中4株(211、92、76、94)對RAW264.7的侵襲量顯著增加。IEC (IPEC-J2)的總值211顯著高于CVCC541，而其他菌株對IPEC-J2的粘附和侵襲無明顯差異或較低。對9株菌株的生物被膜形成情況進行分析，如圖1D所示，各菌株的生物被膜形成與孵育時間(0 ~ 72 h)呈正相關。72 h時，腸球菌64株的OD590值顯著高于CVCC541株，211、62和76株的OD590值均不高于CVCC541株。與之形成鮮明對比的是，其他5株(201、206、114、92和94)的生物膜形成能力明顯低于CVCC541。以CVCC541為對照，檢測了9株enterica分離株18個毒力基因的表達(fold change)。取log2(折疊變化)值生成熱圖(圖1E)。顯然，與其他菌株相比，這些毒力基因在SE211中的表達增加(紅色塊)。
圖1 9株大腸鏈球菌的基本毒力特征
2. SE211基因組的一般特征
基于以上的體外和體內研究，SE211更適合于探索殘留在遺傳水平上的潛在毒性機制。SE211的基因組由一條染色體和一個含有兩個復制子的毒力質粒組成(表1)。通過MLST分型將SE211歸為ST 11。SE211染色體基因組長度為4679,414bp，質粒長度為59372 bp，預測orf分別為4418和86個。GC含量分別為52.17%和51.94%。在染色體基因中，基因組島區約占整個基因組長度(491個基因)的9.1%；其中4418個orf的193個基因被預測為致病菌的毒力因子。此外，SE211質粒中編碼的8個基因被注釋到VFDB基因上。
表1 SE211的基本基因組信息
3. 移動遺傳元素
對于SE211, 9.1%的染色體長度被預測為包含31個GIs的基因組島。其中，GI10和GI31, GI17-18和GI21-22分別包含T1SS、T3SS、T4SS和T6SS。此外，GI1和GI13中含有細胞色素cbi基因 與GI26、GI5-6、GI-9、GI16、GI21、GI23和GI30一起發生，它們是菌毛粘附素和其他毒力決定的gi編碼產物。研究人員分析了被稱為spi的與病毒相關的GIs。結果顯示，其基因組具有SPI-1 ~ SPI-5、SPI-12 ~ SPI-14和C63PI，這些spi的結構和主要功能分別如圖2A所示。
該毒力質粒的blast分析表明，其復制子區域與復制子序列型(RST) S1:A-:B22的不親和性(Inc) F型(FIB和FIIS)相匹配。該質粒中含有編碼關鍵毒力因子的基因，特別是沙門氏菌質粒毒力操縱子(spvABCD)及其調控子(spvR)(表S4，圖2B)。spv質粒與NCBI數據庫中D組腸炎鏈球菌質粒具有較高的同源性，如雞源腸炎鏈球菌質粒p1.1-2C7(登錄號:MN125607.1)。此外，質粒中還含有大量與毒力相關的基因(圖2B，淺藍色)，它們在補體逃避/血清抵抗(rck)和細胞粘附(yeeJ)中發揮作用。在該質粒中還預測了一個不清楚的功能毒力基因(vsdF)。重要的是，這些毒力基因兩側有一些整合移動遺傳元件(iMGEs)，如整合酶(y4lS和resD)和轉座酶(IS481家族、IS630家族和IS200/605家族TnpA1)(圖2B，黃色)。此外，該質粒編碼13個基因(finO到traM)的不完全共軛轉移操縱子(tra操縱子)，覆蓋12577 bp，部分基因(psiA和PSLT051)編碼共軛系統相關蛋白(圖2B，紫色)。然而，缺乏完整的操縱子可能導致沙門氏菌毒力質粒缺乏偶聯轉移。此外，該spv質粒與S. Enteritidis P125109的參考毒力質粒pSENV具有較高的相似性，兩個質粒序列之間的ANI值為100%。該質粒中其他基因與fimbrias (pefABCD, dsbA)(圖2B，藍色)、轉錄調控因子(gadX, rcsB)(圖2B，棕色)、毒素-抗毒素系統(圖2B，橙色)等密切相關。
圖2 SE211基因組中沙門氏菌致病性島(spi)和質粒的詳細定位。
4. SE211與其他腸道沙門氏菌菌株的比較
為了進一步評估其發病機制，我們選擇了另外10株腸鏈球菌和1株亞利桑那鏈球菌對SE211進行比較基因組分析，如表2和圖3所示。從ANI值看，SE211與4株食源性腸炎鏈球菌的相似性最大，其次是2株動物源腸炎鏈球菌、雞高毒沙門氏菌287/91株、3株鼠傷寒沙門氏菌和人致病菌RKS2983。11株腸球菌的基因組具有高度的相似性(圖3A)。系統發育樹的構建基于cgMLST的鄰接分析(圖3B)。結果表明，這些菌株與血清型聚類一致。值得注意的是，SE211聚集在兩種食源性菌株(P125109和EC20121179)附近。特別值得一提的是，P125109是一種人類食物中毒的腸炎鏈球菌，最初在英國分離出來，可追溯到一個家禽養殖場。該樹還揭示了腸炎沙門氏菌、雞鏈球菌和鼠傷寒沙門氏菌血清型中特別高的遺傳異質性。
表2 6株腸道鏈球菌的基本特征及SE211菌株間的ANI值。
圖3 12條腸道沙門氏菌染色體的基因組比較和層次聚類。
5. 258個腸道沙門氏菌MST圖
利用從NCBI下載的12株腸道沙門氏菌(包括SE211和亞利桑那沙門氏菌在內的11株腸道沙門氏菌)和246株腸炎沙門氏菌基因組的基因組進行基于cgmlst的MST圖(圖4)。根據對比計算258個基因組樣本的MST。一共有9個MST集群，SE211屬于MST集群2。除SE211外，腹瀉患者分離的2株腸炎鏈球菌[SE104 (NZ_CP050712.1)和SE109 (NZ_CP050709.1)]和1株臨床分離的腸炎鏈球菌[SJTUF12367v2 (NZ_CP041176.1)]也包括在該群中。腸炎鏈球菌與其他血清型菌株的距離較遠。
圖4 258個腸道沙門氏菌基因組樣本MST圖。
結論
本研究報道了一株腸炎鏈球菌強毒株SE211的表型和遺傳特征。通過全基因組測序進行基因型分析可以了解致病機制，包括致病力、抗菌藥物耐藥性和與暴發相關的分離株的分子進化。SE211的基因組編碼許多毒力因子，特別是位于包含一個毒力質粒、31個GIs和5個原噬菌體區域的MGEs。重要的是，這些MGEs伴隨有像整合酶和轉座酶這樣的iMGEs。研究人員還在SE211基因組中發現了一個完整的CRISPR-Cas系統，這可能也有助于提高其毒性。此外，進化樹和MST顯示出這些基因組之間明顯的距離。分析腸炎沙門氏菌的遺傳和表型特征，有助于我們進一步了解腸炎沙門氏菌的致病機制和系統發育，從而為防治腸炎沙門氏菌感染制定新的策略。
本研究的denovo測序和部分數據分析由上海派森諾生物科技有限公司完成。
