2022-01-12
期刊：《Journal of Hazardous Materials》
影響因子：10.59
文章題目：Comparative cytology combined with transcriptomic and metabolomic analyses of Solanum nigrum L. in response to Cd toxicity
技術手段：RNA-seq，qRT-PCR，LC-MS非靶向代謝
派森諾生物與上海交通大學攜手合作，于近期在《Journal of Hazardous Materials》上發表了龍葵對 Cd 脅迫反應的解毒和耐受分子機制的研究成果。
土壤重金屬污染已成為世界性的環境問題。在所有重金屬中，Cd因其強溶解性、流動性和毒性被廣泛研究。Cd 在植物組織中很容易被吸收、運輸和積累。因其無法被生物降解，在植物中會長期存在。而且由于食物鏈污染，對人類和動物健康也會構成潛在威脅。因此，對重金屬污染（尤其是Cd）土壤進行修復治理勢在必行。
龍葵（Solanum nigrum L.）是一年生或多年生雜草植物，具有快速生長和鎘超積累特性。大量研究探索了龍葵對鎘脅迫反應的形態和生理生化機制，包括生物量、植物螯合素（PCs）合成、光合色素、抗氧化系統和有機酸分泌等。之前的研究表明，隨著 Cd 濃度的增加，龍葵幼苗的細胞壁成分也會發生變化。然而，龍葵細胞壁對鎘脅迫反應的潛在分子機制仍不清楚。
本研究利用細胞學以及轉錄組和代謝組學的聯合分析，為龍葵對 Cd 脅迫反應的分子機制提供新的見解。假設不同濃度的 Cd 會引起與龍葵細胞壁相關的一些基因和代謝物的異常表達。研究的目的是（a）觀察不同Cd 脅迫下龍葵組織的Cd 積累位點和細胞超微結構的變化；（b）確定關鍵的 Cd 脅迫響應差異表達基因（DEGs）/代謝物（DEMs）及其相關的代謝通路；（c）揭示龍葵對 Cd 脅迫反應的解毒和耐受分子機制。
研究思路
研究結果
1.鎘脅迫下根代謝物變化
為闡明龍葵根在不同 Cd 脅迫下的反應機制，采用非靶向代謝組學 (LC-MS) 分析方法，以確認與根固定Cd相關的差異代謝物。多元統計分析 PCA和OPLS-DA結果顯示，對照組和Cd處理組有明顯分離（圖1），而不同劑量的Cd處理組在OPLS-DA中也明顯分開（圖1b）。以上結果表明，在不同濃度的鎘脅迫下，根的代謝物組成存在顯著差異。所有組中共鑒定出 361 個代謝物，其中有128個是五組中常見的差異代謝物（DEM，VIP>1和 P<0.05）。這些DEM主要為脂質（23.43%）、核苷酸（14.06%）、氨基酸（14.84%）、碳水化合物（11.72%）等。
圖1 PCA和OPLS-DA分析
2.差異表達代謝物的KEGG分析
KEGG 富集分析進一步確認龍葵根中與Cd毒性反應相關的關鍵代謝通路。針對DEMs進行富集分析發現，7條常見通路受到顯著干擾，包括（a）嘧啶代謝，（b）檸檬酸循環（TCA循環），（c）丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，（d）泛酸和輔酶A生物合成，（e）乙醛酸和二羧酸代謝，（f）谷胱甘肽代謝，以及（g）酪氨酸代謝（圖 2a）。這些代謝通路主要涉及 19 個 DEMs，包括 6 個氨基酸、6 個碳水化合物和 7 個核苷酸。19 個 DEMs 的相對豐度如圖2b所示。以上結果表明，這些代謝物在根對Cd 毒性的反應中起關鍵作用。
圖2 氣泡圖和箱線圖分析
3.轉錄組測序分析
為進一步了解龍葵對Cd 解毒的分子機制，進行轉錄組測序分析。相關性分析表明，后續實驗是可靠的以及樣本選擇的合理性(圖3a)。此外，PCA分析表明，CK組和不同Cd處理組之間有明顯的分離(圖3b)，這與熱圖的結果一致。對五組樣本進行兩兩比較，分析差異表達基因(DEGs)。如圖3c和d所示，在不同Cd處理和對照組樣品中分別鑒定出15036個 (8361個上調， 6675個下調)、13763個 (5399個上調， 8364個下調)、16536個 (12164個上調， 4372個下調)、11133個 (3850個上調， 7283個下調)差異基因。此外，我們還篩選出在各組中共表達的1049個上調基因和2859個下調基因，說明龍葵根系在應對不同Cd脅迫時激活了大量基因的表達。
圖3 相關性熱圖、PCA以及維恩圖分析
4.差異表達基因的GO和KEGG富集分析
通過GO富集分析四個比較組(CK vs Cd 25、CK vs Cd 50、CK vs Cd 75、CK vs Cd 100)中DEGs的特定生物學功能。GO分析表明，龍葵可通過增強GO條目如催化活性、核糖體、翻譯以及防御機制來提高植物對Cd的耐受性。
為進一步明確鎘脅迫反應的生物通路，對所有的差異基因進行KEGG富集分析。結果表明，龍葵可以通過調節氨基酸代謝、脂質代謝、碳水化合物代謝、增強信號轉導來降低Cd對植物的毒害作用。此外，本研究重點研究了4個比較組中常見的差異基因(1049個上調，2859個下調)的生物功能，因為這些基因與龍葵的Cd耐受和解毒機制更為相關。通過KEGG分析對這些DEGs進行分類。結果發現，大多數DEGs主要富集在代謝通路(圖4a和b)，上調的差異基因顯著富集在核糖體、苯丙素生物合成、谷胱甘肽代謝、氮代謝、角質，琥珀和蠟的生物合成相關的通路。下調的DEGs則在核糖體、異喹啉生物堿合成、吞噬體、酪氨酸代謝和光合生物碳固定通路等5個通路中顯著富集(圖4c)。上述結果與代謝組學結果基本一致，表明Cd脅迫顯著影響了植物的核糖體、氮代謝、碳代謝和次級代謝等生理過程。
圖4 KEGG富集分析
5.差異基因與細胞壁代謝有關
基于之前發表的數據和超微結構分析，細胞壁重塑在Cd解毒過程中發揮著重要作用。因此，我們重點研究了參與細胞壁代謝通路的差異基因。KEGG富集分析發現，苯丙素生物合成與參與木質素的CW 代謝關鍵成分有關。在四個比較組(CK vs Cd 25, CK vs Cd 50, CK vs Cd 75, CK vs Cd 100)中，分別有127個，118個，152個和126個差異基因均與木質素代謝有關。有趣的是在這4個比較組中，42個共有DEGs(24個上調，18個下調)參與了LAC、PER、PERX、BGL等過程，其中與PER相關的差異基因數量最多(圖5a、b)。
除了木質素的生物合成通路外，還發現許多DEGs參與了細胞壁成分重塑過程 (圖5c)。同時，結合代謝組學結果發現一些與細胞壁代謝相關的DEMs也發生了改變，如反式阿魏酸、D-果糖、纖維二糖、D-葡萄糖6-磷酸、半乳糖二酸(圖6a)。上述結果表明，Cd脅迫對龍葵細胞壁生物合成代謝相關的基因和代謝物表達有顯著影響。
圖5 差異基因熱圖分析
圖6 箱線圖和qRT-PCR驗證
6.qRT-PCR驗證
為驗證RNA-Seq數據的可靠性，選擇18個與細胞壁代謝相關的DEGs進行qRT-PCR檢測。除TRINITY_DN 39885和20427兩個基因外，所選基因的表達趨勢與Illumina測序結果一致(圖6b)，表明RNA-Seq數據的可靠性。
總 結
本研究發現Cd會顯著抑制植物生長，并增加Cd的轉運系數和根細胞壁厚度，同時破壞葉細胞中葉綠體的超微結構。代謝組學分析表明，不同的 Cd 濃度會引起龍葵中氨基酸、碳水化合物和核苷酸代謝通路的變化，如 β-丙氨酸、L-谷氨酸、丙酮酸、D-果糖、胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷等。而且，變化的大小與濃度有關。有趣的是，隨著 Cd 脅迫的增加，大多數碳水化合物的濃度依賴性也會增加，表明龍葵主要通過激活能量代謝通路來降低 Cd 毒性。此外，為明確龍葵對Cd 解毒的分子機制，RNA-seq 分析揭示了許多關鍵的 Cd 誘導的 DEGs 及其參與的細胞壁成分（果膠、木質素和纖維素等）生物合成通路。我們的結果將為研究龍葵對Cd 脅迫反應的分子機制提供新的見解。此外，該方法可能在未來用于研究不同金屬元素與植物之間的互作。
本研究的RNA-seq和LC-MS均由上海派森諾生物科技有限公司完成。
