2022-01-11
期刊：《Enzyme and Microbial Technology》
影響因子：3.493
派森諾與中國海洋大學合作，在《Enzyme and Microbial Technology》（影響因子：3.493）發表最新研究成果！本研究分離得到了一個抗金黃色葡萄球菌（S. aureus）的強毒噬菌體qdsa002，并表達和純化了該噬菌體的內溶素（Lys84）及其結構域，發現Lys84對S. aureus具有較強的溶解活性，且比qdsa002具有更寬的殺菌譜，結果表明Lys84及其結構域可能是控制S. aureus及其生物膜的替代抗生素。
研 究 背 景
S.aureus是一種病原體，可引起廣泛的急性化膿性感染，如菌血癥、心內膜炎、膿腫、脊髓炎和肺炎等。由于耐甲氧西林S.aureus（MRSA）的傳播，細菌感染的治療變得越來越成問題。此前在醫院流行的MRSA菌株，現在已知可以傳播到外部環境，并已從食物和牲畜中分離出來。S.aureus生物膜由細菌細胞嵌入“糖萼”組成，糖萼主要由細菌胞外聚合物（EPS）組成。EPS可以介導生物膜與表面的粘附，提供機械穩定性，并有助于生物膜內聚三維聚合物網絡的建立。細菌生物膜起到保護細菌的屏障作用，降低細菌對抗生素的敏感性，因此抗生素對這些生物膜相關病原體的療效較差。這些問題正成為食品安全的新問題，迫切需要開發新型的S.aureus和細菌生物膜抗菌劑。
內溶酶是噬菌體在其裂解復制周期結束時產生的水解酶，其能夠通過消化肽聚糖聚合物來破壞細菌細胞壁，并導致細菌細胞的低滲裂解。與噬菌體和常規抗生素相比，內溶素具有宿主特異性，無論在細菌處于何種生理狀態都能迅速殺死細菌，且不易產生耐藥性。此外，內溶素可以殺死嵌入在生物膜基質中的復制和非復制的細菌，從而破壞細菌的生物膜。噬菌體來源的內溶素在對抗革蘭氏陽性菌的耐藥菌株及其生物膜合成方面具有重大作用。以往的研究主要評估了內溶酶對S.aureus及其生物膜的控制效果，但是關于內溶素及其結構與在溶膜和抗生物膜活性方面的研究很少有報道。本研究分離了感染S.aureus ATCC43300的強毒噬菌體qdsa002，并對其形態和基因組進行了表征。
研 究 材 料 與 方 法
1. 實驗材料：青島市污水中分離得到的強毒噬菌體qdsa002
2. 分析內容：噬菌體基因組測序、噬菌體形態學鑒定、內溶酶基因克隆&表達&純化和生理生化鑒定等等。
研 究 結 果
1. 噬菌體qdsa002的形態學和基因組分析
使用菌斑純化技術從青島市污水中分離得到S. aureus噬菌體qdsa002，TEM顯示，該噬菌體是Myoviridae家族的一員，其頭部等距，尾部可收縮。將噬菌體qdsa002與Myoviridae家族下的Twort-like噬菌體基因組進行比較，發現其與噬菌體GH15、MSA6、G1、IME-SA1、Sb-1、K和ISP具有較高的同源性(同源性大于62.72%)，與其他噬菌體的同源性在36.02% ~ 37.82%之間。對該噬菌體進行高通量測序，結果發現基因組大小為142,499bp，GC含量為30.26%，231個ORF，其中有64個注釋到相應的功能。
圖1 噬菌體qdsa002的形態圖及基因組圈圖
2. 噬菌體qdsa002可能內溶素的生物信息學分析、表達和純化
對噬菌體qdsa002基因組進行生物信息學分析，發現該噬菌體具有由穿孔素和內溶素兩部分組成的裂解系統。其中ORF84編碼推測為內溶酶（命名為Lys84），該基因具有兩個催化結構域：一個CHAP結構域（半胱氨酸和組氨酸以來的酰胺水解酶/肽酶）和一個中心Amidase_2結構域，一個細胞壁結合結構域SH3b。對該基因進行克隆、純化和表達，獲得了更多的Lys84產量；SDS-PAGE發現，表達的Lys84以可溶性蛋白和包涵體的形式存在；純化出的溶出蛋白Lys84的蛋白帶長度約為54K，與預測的分子量（54.8K）相一致。
圖2 內溶酶Lys84的鑒定
3. Lys84的裂解活性
使用濁度還原法評估純化后的Lys84裂解活性，如圖所示，所有的樣本OD595nm的初始值都接近1.40，5h內，對照組的OD595nm值基本穩定，而2.5、5.0、10和20um Lys84處理組的OD595nm值分別從1.37下降到0.81、0.41、0.21和0.24。
圖3 經Lys84處理的S. aureus懸浮液的OD595nm值
4. 噬菌體qdsa002和Lys84的裂解譜
對噬菌體qdsa002和Lys84的裂解譜進行鑒定，結果表明，噬菌體qdsa002能對38株供試菌株中的32株進行裂解，與噬菌體qdsa002相比，內溶素Lys84具有更寬的溶出譜，能夠溶解所列出的所有S. aureus菌株。
表1 噬菌體qdsa002和Lys84的裂解譜
5. Lys84的生物膜較少效果
通過掃描電鏡觀察和結晶紫染色觀察Lys84對S. aureus生物被膜的影響，對照組的SEM顯示，培養72h后形成的S. aureus生物膜牢固，細胞聚集緊密。與對照組相比，5um Lys84處理組的生物被摸基質和細菌細胞數量顯著減少。此外，10um Lys84處理2h后，幾乎所有的細菌被摸和細胞都被去除。結果表明，Lys84濃度大于10um時，可以有效去除S. aureus的生物膜。
圖4 Lys84對S. aureus生物膜的影響
6. Lys84結構域的表達與純化
分析克隆了3個Lys84結構域，在E.coli BL21中表達并通過親和層析純化，CHAP、Amidase_2、SH3b的SDS-PAGE結果顯示其分別在18、26、12kda處有一條蛋白帶。
圖5 SDS-PAGE分析(A)CHAP;(B)Amidase_2;(C)SH3b
7. Lys84及其結構域的裂解活性比較
經Lys84處理的金黃色葡萄球菌懸液及其結構域組合的OD595 nm值如圖下圖所示，SH3b的對照組和處理組的OD595 nm值差異無統計學意義，表明Lys84的CBD不具有溶解能力。而Lys84及其兩個催化結構域CHAP和Amidase_2對S. aureus均具有一定的降解活性，其OD595 nm值分別降低了1.05、0.64和0.62。CHAP和Amidase_2聯合應用對細菌光密度的降低顯著高于單獨應用CHAP和Amidase_2，但仍略低于Lys84。同時，CHAP、Amidase_2和SH3b組合對S. aureus的降解活性有限，僅使菌懸液的OD595 nm值降低0.49。
圖6 Lys84及其結構域組合對S. aureus的裂解活性
8. Lys84蛋白及其結構域抗生物膜活性的比較
與對照組相比，Lys84去除了S. aureus生物膜生物量的88.01%。CHAP、Amidase_2和SH3b處理后細菌生物膜丟失的比例分別為74.20%、61.70%和0.52%。同時，CHAP、Amidase_2和CHAP、Amidase_2、SH3b組合分別造成S. aureus生物被膜損失的75.06%和44.30%
圖7 Lys84及其結構域組合對S. aureus的抗生物被膜活性
研 究 結 論
本研究發現來自噬菌體qdsa002的溶菌素Lys84對S. aureus及其生物膜具有較強的溶菌活性和抗生物膜活性；Lys84的溶解和抗生物膜活性主要依賴與CHAP和Amidase_2結構域。此外，Lys84需要結構域的組裝以獲得最佳的構架，從而獲得最大的活性。因此，本研究為Lys84及其結構域在食品工業中對S. aureus及其生物膜的應用提供了理論依據和參考。
本研究的denovo測序和部分數據分析由上海派森諾生物科技股份有限公司完成
