2021-12-29
期刊：《PLOS ONE》
影響因子：3.24
文章題目：Integrative analyses of metabolome and transcriptome reveals metabolomic variations and candidate genes involved in sweet cherry(Prunus avium L.) fruit quality during development and ripening
發(fā)表期刊：《PLOS ONE》
技術(shù)手段：RNA-Seq、LC-MS代謝組學
派森諾與魯東大學攜手合作，于近期在《PLOS ONE》上發(fā)表關(guān)于代謝組和轉(zhuǎn)錄組的聯(lián)合分析，揭示了甜櫻桃果實發(fā)育和成熟過程中涉及的代謝變化以及篩選到的相關(guān)候選基因。
研究背景
甜櫻桃(Prunus avium L.)因其外觀誘人、口感鮮美、營養(yǎng)價值豐富，是一種廣受歡迎的商業(yè)果樹作物。甜櫻桃在發(fā)育成熟過程中糖、有機酸、色素、揮發(fā)性芳香物質(zhì)等成分變化迅速，是果實品質(zhì)研究的理想模型。糖和酸的積累形成了獨特的口感，它們是評價果實生理和口感方面的重要因素。甜櫻桃含有多種多酚化學物質(zhì)，具有較高的抗氧化活性，對人體健康有益。因此，對甜櫻桃發(fā)育和成熟過程的研究可以幫助我們了解果實質(zhì)量和形狀的變化，特別是與味道、顏色和健康相關(guān)的營養(yǎng)物質(zhì)。
本研究旨在利用廣泛靶向代謝組學方法對黑珍珠甜櫻桃果實品質(zhì)形成過程進行研究。此外，采用代謝組學和轉(zhuǎn)錄組學相結(jié)合的方法，研究甜櫻桃發(fā)育和成熟過程中顯著差異表達代謝產(chǎn)物(DEMs)和差異表達基因(DEGs)之間的相關(guān)性。為了進一步研究品質(zhì)的形成，我們重點研究了與糖、有機酸和類黃酮代謝相關(guān)的DEMs和DEGs。本研究將為從代謝產(chǎn)物變化和分子機制方面理解果實品質(zhì)形成提供了新的思路。
技術(shù)路線
研究結(jié)果
為了研究甜櫻桃果實發(fā)育過程中的品質(zhì)和代謝變化，我們選擇了4個發(fā)育階段(10、25、33和40天)進行實驗和代謝分析。不同時期采集的甜櫻桃果實外觀如圖1A所示。在40天時，果實顏色逐漸由紅色變?yōu)榘导t色(圖1A)。值得注意的是，果實硬度從10 天時的11.6 N迅速下降到33天時的1.2 N，在40 天時的暗紅色成熟期達到0.7 N(圖1B)。可溶物與果實硬度呈負相關(guān)，從10天的6.8%持續(xù)增加到40天的18.2%(圖1C)。果實顏色指標a*/b*的比值從10 天時-0.46迅速增加到40天時的4.1，表明果實的顏色從綠色變?yōu)榧t色(圖1D)。此外，甜櫻桃果實發(fā)育過程中花青素含量也與顏色變化相一致，暗紅色成熟期花青素含量達到23.3 mg/100 g (圖1E)。
圖1黑珍珠甜櫻桃果實發(fā)育和生理變化
2、甜櫻桃的代謝組學分析揭示了發(fā)育階段的代謝物動態(tài)變化
為了更好的了解甜櫻桃發(fā)育過程中的代謝物變化，在四個發(fā)育階段應(yīng)用了基于LC-MS/MS的廣泛靶向代謝組學。如圖2A所示，各代謝物在不同階段表現(xiàn)出明顯的差異，重復(fù)之間具有較高的可重復(fù)性。圖2B顯示4個發(fā)育階段差異表達代謝產(chǎn)物(DEMs)的熱圖分析，結(jié)果表明許多代謝物在每個發(fā)育階段都有高表達。根據(jù)不同發(fā)育階段DEMs的變化情況，進行聚類分析，將DEMs按其變化趨勢分為9類(圖2C和2D)。簇8和簇9的代謝產(chǎn)物在不同發(fā)育階段的表達量呈現(xiàn)出相似的增長趨勢。有趣的是，甜櫻桃果實的TSS、a*/b*比值和花青素含量也出現(xiàn)了這種趨勢(圖1C-1E)，而這與甜櫻桃果實的營養(yǎng)和色澤形成密切相關(guān)。
圖2甜櫻桃發(fā)育至成熟的代謝組學動態(tài)研究
3、代謝物的多變量分析
火山圖顯示了10天 vs 25天、25天 vs 33天和33天 vs 40天的所有差異代謝物，分別是167個 (115個上調(diào)，52個下調(diào))、115個 (84個上調(diào)，31個下調(diào))和135個 (41個上調(diào)，94個下調(diào))(圖3A)。三個比較組之間的共同49差異代謝物 (圖3B)，4個果實發(fā)育階段的49種常見代謝物聚類熱圖如圖3C。從圖3C可以看出，大部分代謝物在青果期至紅果期(33天)積累，在33天時達到峰值(圖3C)。
圖3甜櫻桃果實不同發(fā)育階段代謝產(chǎn)物積累的差異
此外，對DEMs進行KEGG通路分析，以確定顯著富集的代謝通路。三個比較組中最顯著富集的通路都涉及代謝途徑和次生代謝物的生物合成(圖4A-4C)。為了進一步研究甜櫻桃發(fā)育過程中顯著變化的代謝物，我們繪制了三個比較組中10個最顯著富集代謝通路中顯著差異的代謝物熱圖(圖4D-4F)。除苯甲酸外，其他9種代謝物在10天的表達量顯著高于25天(圖4D)。對于33天 vs 40 天，前10個DEMs在40天的表達均顯著高于33天(圖4F)。我們還關(guān)注了10天vs 40天的DEMs，以觀察整個生長期代謝物的變化，其中6種黃酮類化合物在40天均呈顯著上調(diào)趨勢(圖4G)。
圖4 差異代謝產(chǎn)物的KEGG富集分析
4、轉(zhuǎn)錄組變化以及轉(zhuǎn)錄組學和代謝組學聯(lián)合分析
對不同發(fā)育階段的甜櫻桃樣本進行RNA-seq分析， PCA中PC1顯示10天、25天樣本與33天、40天樣本明顯分離，而在PC2中， 33天和40天樣本位于相鄰的位置(圖5A)。在三個比較組中，共鑒定出6724個DEGs。圖5C的熱圖顯示了6724個DEGs的表達水平，它們表現(xiàn)出不同的表達模式。
在每個比較組中，所有DEMs和DEGs的變化由九象限圖(圖5D)顯示。象限3和象限7的DEMs和DEGs為正相關(guān)，象限1和象限9的DEMs和DEGs為負相關(guān)(圖5D)。與10天 vs 25天相比，25天 vs 33天和33天 vs 40天的DEMs和DEGs數(shù)量明顯減少，表明甜櫻桃從青果期到褪青期變化強烈。為了研究顯著變化的代謝物，我們使用相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖進一步研究前10個DEMs與主要DEGs (圖5E-圖5H)。相關(guān)分析表明，這些DEGs可能在甜櫻桃整個發(fā)育時期的關(guān)鍵代謝中發(fā)揮直接或間接的調(diào)控作用。
圖5 代謝組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析
5、糖、有機酸和類黃酮代謝相關(guān)的表達模式
為了進一步探討甜櫻桃發(fā)育和品質(zhì)形成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，我們對甜櫻桃發(fā)育和品質(zhì)形成高度相關(guān)的DEGs與前10個顯著差異代謝物在四個比較組的代謝途徑進行可視化展示(圖6)。根據(jù)前10個顯著差異代謝物的分類屬性，與之高度相關(guān)的DEGs富集在糖、有機酸、類黃酮代謝途徑(圖6)。
在糖代謝方面，主要代謝物G6P在10天 vs 25天中顯著下調(diào)，但從33天到40天中顯著積累(圖6A)，40 天的G6P含量顯著高于10 天的甜櫻桃(圖6A)。與G6P形成和代謝密切相關(guān)的酶包括己糖激酶(HK)、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶(PGI)和磷酸葡萄糖醛基酶(PGM)。PGI (A5)的轉(zhuǎn)錄水平在10天至25天顯著增加，在以后的發(fā)育階段維持在較高水平。蔗糖-磷酸合成酶(SPS, A10)的表達與PGI (A5)的表達完全相反，在33天時處于較低水平，然后從全紅到暗紅階段急劇增加。
對于有機酸代謝，一些主要的代謝物在這一途徑富集，包括檸檬酸、酮戊二酸、谷氨酸、延胡索酸、天冬氨酸和天冬酰胺(圖6B)。從青果期(10天)到褪青期(25天)，檸檬酸、酮戊二酸、延胡索酸和天冬氨酸含量明顯降低，從全紅期(33 天)到暗紅期(40天)，檸檬酸、酮戊二酸、延胡索酸和天冬氨酸含量增加。
在類黃酮代謝方面，槲皮素、兒茶素和花青素等主要代謝物在果實發(fā)育過程中顯著增加，而它們的前體苯丙氨酸則相反(圖6C)。花青素的變化趨勢與花青素濃度的變化趨勢一致(圖1E)。在這項研究中,幾乎所有參與類黃酮代謝途徑的DEGs在33天或40天的表達量達到最高。與此相反，在果實發(fā)育過程中，4CL (C2)和花青素還原酶(ANR, C13)的水平降低。ANR的表達水平與花青素含量的趨勢相反(圖6C)。
圖6 糖、有機酸和類黃酮代謝通路
文章小結(jié)
甜櫻桃果實在發(fā)育和成熟過程中，代謝產(chǎn)物的組成和含量的不同導致了果實品質(zhì)性狀的顯著變化。味道、顏色和營養(yǎng)是水果品質(zhì)的重要組成部分。主要代謝產(chǎn)物在青果期、褪青期、全紅期和暗紅期之間存在顯著差異，這可能是導致不同時期果實品質(zhì)差異的主要原因。此外，結(jié)合代謝組和轉(zhuǎn)錄組分析表明，糖、有機酸、類黃酮代謝產(chǎn)物和相關(guān)基因之間存在顯著相關(guān)性。這些相關(guān)的DEGs可能在果實的生長、發(fā)育和成熟過程中發(fā)揮重要作用。這些結(jié)果為甜櫻桃代謝物以及果實品質(zhì)性狀的分子機制研究提供了更廣闊的視角。
本研究中轉(zhuǎn)錄組和代謝組的測序與數(shù)據(jù)分析工作由上海派森諾生物科技有限公司完成。
