2021-12-28
期刊：《Aquaculture》
影響因子：4.242
派森諾與江蘇省農業科學院合作，在海洋與淡水生物學領域的《Aquaculture》發表研究成果！本研究在大黃魚（Larimichthys crocea）中發現噬菌體vB_VhaS_PcB-1G能有效預防(93.33%)和控制(86.67%)V. harveyi弧菌感染。噬菌體的抗菌作用表明，該菌種有可能作為一種抗菌劑用于控制大黃魚的V. harveyi弧菌感染和水產養殖中的弧菌病。
1、研究背景
大黃魚(Larimichthys crocea，LC)和黃花魚(Larimichthys polyactis)是中國沿海重要的生態和商業物種。近年來，隨著養殖規模的不斷擴大，養殖密度急劇增加，以及水污染和環境污染的影響，造成魚類疾病經常發生。其中弧菌病是水產養殖中最嚴重的細菌性病害，對LC養殖業造成巨大威脅和經濟損失。弧菌種類占海洋環境中可培養異養細菌的很大一部分，V. harveyi、溶藻弧菌和副溶血性弧菌與魚類疾病相關。由V. harveyi弧菌和溶藻弧菌引起的弧菌病在中國養殖區爆發導致水產品在相對較短的時間內大量死亡。雖然化學治療是一種快速有效的治療或預防細菌感染的方法，但化學藥物的頻繁使用導致了細菌耐藥菌株的產生。由于抗生素殘留對人類健康和環境構成威脅，一些國家已禁止使用抗生素，所以水產養殖業需要新的替代的控制方法，以降低死亡率并盡量減少對人類健康和環境的影響。因此，噬菌體作為一種抗菌劑越來越受到人們的重視。本研究從LC中分離和鑒定了新的V. harveyi弧菌噬菌體，并確定了其宿主范圍和基因組信息。大黃魚體內感染實驗證實了噬菌體的抗菌作用，此研究結果可為水產養殖中弧菌病的防治提供參考。
2、研究材料與方法
2.1實驗材料：從福建省寧德市LC感染的腸、胰、肝、中腎等組織中分離到V. harveyi病毒54株；
2.2 測序平臺：Illumina HiSeq
2.3 分析內容：噬菌體基因組測序、藥敏實驗、毒力基因分析、噬菌體形態學鑒定、宿主范圍鑒定等。
3、研究結果
3.1 藥敏實驗
從大黃魚中分離到54株V. harveyi弧菌，選擇β-內酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類、磺胺類、四環素類、多肽類、利福霉素類、頭孢菌素類等13種抗生素進行藥敏試驗。此外，54株V. harveyi弧菌對多粘菌素E、阿莫西林、磺胺甲惡唑、氨芐西林、四環素和慶大霉素耐藥。大多數菌株對頭孢噻肟(96.2%，52/54)、阿米卡星(92.6%，50/54)和鏈霉素(92.6%，50/54)產生耐藥性。部分分離株對恩諾沙星(88.9%，48/54)、卡那霉素(87.1%，47/54)、環丙沙星(51.9%，28/54)和利福平(72.2%，39/54)耐藥(圖1)。同樣，所有分離株對氨芐青霉素均表現出較強的耐藥性。值得注意的是，該菌株對利福平、阿莫西林、鏈霉素、卡那霉素、氨芐西林、環丙沙星、恩諾沙星和頭孢噻肟也存在中度耐藥；少數菌株對利福平和環丙沙星敏感。所有V. harveyi弧菌分離株均對至少9種抗生素表現出多重抗生素耐藥性，94.4%(51/54)對10種藥物耐藥，85.2%(46/54)對11種藥物耐藥，64.8%(35/ 54)對12種藥物耐藥，37.0%(20/54)對本研究選擇的13種藥物耐藥(圖1)。
圖1 54株V. Harveyi弧菌對抗生素耐藥性的頻率
3.2 抗性基因檢測
54株V. Harveyi弧菌的抗性基因檢測結果見圖2。四環素耐藥基因tetA最常見，檢出率為81.5%(44/54)，其次為氨基糖苷aac(6′)-Ib和sulsulamine耐藥基因sul2/sul1分別為13.0%(7/54)和9.3%(5/54)；廣譜β-內酰胺酶(ESBL)耐藥基因mecA和喹諾酮類藥物耐藥基因oqxA攜帶頻率分別為7.4%(4/54)；大環內酯類耐藥基因ermA和ermC的出現頻率為9.3%(5/54)；87.0%的分離株至少攜帶1個抗性基因，4株分離株同時攜帶5個ARGs。
圖2 V. Harveyi弧菌耐藥基因的頻率。
3.3 毒力因子分析
為研究分離株的致病性，分別對毒力相關基因(toxR和toxS)、金屬蛋白酶基因(vhpA和vhpB)、溶血素基因(vhhA和vhhB)，調控相關基因(luxR)、鋅蛋白酶基因(pap6)和鞭毛結構基因(flaA)進行了驗證。結果如圖3所示,其中toxR是最常見的基因，檢出率為75.9%(41/54)，其次是luxR(74.1%，40/54)、vhhB(74.1%，40/54)、vhhA(64.8%，35/54)、toxS(3.7%，2/54)和f1aA(3.7%，2/54)，VhpA、vhpB和pap6在所有分離株中均未檢出。59.3%的分離株攜帶4種毒力基因，其中2株攜帶5種毒力基因。
圖3 V. harveyi分離株中毒力基因的頻率。
3.4 噬菌體分離與鑒定
從中國東海采集大黃魚肉，從V. harveyi弧菌Vh-46菌株中分離得到感染的V. harveyi弧菌噬菌體，此噬菌體是一種新的噬菌體vB_VhaS_PcB-1G(此后命名為PcB-1G)。電子顯微鏡顯示，PcB-1G具有125 nm長的尾巴和68 nm的距衣殼等(圖4)。根據國際病毒分類，PcB-1G被歸為Siphoviridae科。
圖4 噬菌體vB_VhaM_PcB-1G的電子顯微照片
3.5 宿主范圍確定和一步增長曲線
噬菌體PcB-1G具有較短的潛伏期(~10分鐘)和較高的爆發量(~ 210 PFU/Cell?1)(圖5)。利用V. harveyi弧菌分離物測定噬菌體PcB-1G的抑制活性，結果顯示61%(33/54)的V. harveyi弧菌分離株能被噬菌體PcB-1G抑制。培養48h后，噬菌體斑點中未發現寄主克隆，說明噬菌體具有較強的溶解能力。
圖5 噬菌體vB_VhaM_PcB-1G與宿主Vh-46在37?C的一步生長曲線。
3.6 體外噬菌體裂解能力
用噬菌體PcB-1G在MOI為10時處理Vh-46后，測定其生長曲線(圖6)。對于Vh-46菌株，噬菌體PcB-1G對細菌生長的抑制作用高于對照。處理5 h后，Vh-46的OD值下降至0.09；Vh-46發酵液對照的OD值增加到2.0。在較低的MOI(10)下，噬菌體PcB-1G使細菌的生長速度下降，表明噬菌體PcB-1G在體外對Vh-46菌株的作用更有效。
圖6所示。Vh-46被噬菌體vB_VhaM_PcB-1G在moi10和以Vh-462216E培養基為對照，以光密度為指示劑作用5 h時的生長曲線。
3.7 DNA提取和全基因組測序
對分離的噬菌體進行基因組DNA高通量測序，并對其進行基因組組裝和注釋，分析顯示，噬菌體PcB-1G基因組為48,719 bp的雙鏈DNA，具有80個orf， GC含量43.06%。比較分析發現PcB-1G的orf與一些噬菌體弧菌具有同源性（圖7）。噬菌體PcB-1G基因組中未檢測到rRNA、tRNA、抗生素耐藥性、溶源性和毒力基因。NR預測到26個orf，而67.5%基因的是PcB-1G獨有的且沒有注釋到功能的。其中3個orf與包括噬菌體弧菌在內的其他噬菌體的基因組具有高度的同源性，但其功能是位置的；9種假設蛋白質與其他菌種的噬菌體具有低同源性，包括假交替單胞菌噬菌體、沙門氏菌噬菌體、希瓦氏噬菌體和鏈霉菌噬菌體；其余54個orf與任何已知基因序列的同源性都很低。綜上所述，噬菌體PcB-1G是一種新型可以裂解V. Harveyi弧菌的噬菌體。
圖7 V. harveyi弧菌vB_VhaM_PcB-1G基因組
4、研究結論
本研究從LC培養區共鑒定出54株V. harveyi弧菌，94.4%(51/54)的V. harveyi弧菌分離株對10種抗菌素具有耐藥性。V. harveyi弧菌的主要毒力因子是細胞外蛋白酶、外膜蛋白、溶血素、酯酶、磷脂酶、外毒素等相關基因。其中ToxR的頻率高達75.9%，63%的菌株攜帶至少4種毒力基因。研究證明，噬菌體PcB-1G減輕了V. harveyi弧菌感染的可能性。因此對于養殖的LC，需要考慮使噬菌體PcB-1G在水中發揮的作用，以達到對弧菌有效的預防。
本研究的denovo測序和部分數據分析由上海派森諾生物科技有限公司完成。
