2021-12-22
期刊：《Cellular & Molecular Immunology》
影響因子：11.532
文章題目：HIV-1 Vif suppresses antiviral immunity by targeting STING
技術手段：RNA-seq， Co-IPs，qpcr， pulldown， RNA knockdown等
派森諾與中國人民解放軍陸軍軍醫大學&復旦大學攜手合作，于近期在《Cellular & Molecular Immunology》上發表HIV-1 Vif通過靶向STING抑制抗病毒免疫的研究成果。
研究背景
HIV-1感染誘導的cGAS-STING-TBK1-IRF3信號激活先天免疫產生I型干擾素(IFN)。HIV-1非結構蛋白病毒感染因子(Vif)在HIV-1復制中是必不可少的，因為它降低了宿主限制因子APOBEC3G。然而，它是否以及如何調節宿主的免疫反應仍有待確定。
研究內容
Vif抑制抗病毒先天免疫反應
Vif（病毒感染性因子）過表達顯著抑制HSV -1（單純皰疹病毒 1）誘導的IFNB mRNA表達(圖1A)。HIV-1感染促進抗病毒信號通的激活，從而誘導I型干擾素;趨化因子；ISGs；促炎因子，包括IFN-β、CXCL10、ISG15和腫瘤壞死因子(TNF) 的產生。研究發現Vif的缺失導致MDMs中IFN-β和TNF水平顯著升高(圖1B)。因此，HIV-1ΔVif-infected MDMs中IFNB、CXCL10、ISG15和TNF mRNA的表達，HIV-1ΔVif-infected Jurkat細胞中IFNB、IFNG、IL2和CD69 mRNA的表達也高于感染HIV-1株的細胞(圖1C)。此外，以HIV-1 Tat-Rev mRNA表達為代表的病毒復制水平在HIV-1ΔVif-infected細胞中明顯低于感染HIV-1的細胞(圖1D)。這些發現表明HIV-1 Vif抑制細胞因子的產生。
圖1 Vif抑制抗病毒免疫反應
為了探討Vif的調控作用及其對宿主整體抗病毒免疫的影響，我們對感染HIV-1或HIV-1ΔVif的人類MDMs進行了RNA-seq分析。與HIV-1感染相比，MDMs感染HIV-1ΔVif導致236個差異表達基因(185個上調，51個下調;圖1E和圖2A)。基于差異基因表達譜的蛋白-蛋白相互作用(PPI)分析表明，宿主抗病毒基因之間存在顯著的相互作用網絡，包括ISG15、CXCL10、MX2、STAT1、TRIM22、IFIT家族基因和OAS家族基因(圖2B)。
對上調基因的功能分類分析顯示，正向調節宿主對病毒感染的防御反應增加(圖2C)。GO分析顯示，Vif的缺失導致與I型IFN信號通路、細胞對I型IFN的反應、對病毒的防御反應和先天免疫反應相關的多個基因表達上調(圖1F和圖2D)。同樣，KEGG分析表明，差異基因顯著富集的抗病毒免疫信號通路，包括NOD-like受體信號通路、胞質DNA傳感通路、RIG-I-like受體信號通路和趨化因子信號通路(圖2E，F)。鑒于Vif在宿主抗病毒轉錄程序調控中的關鍵作用，研究認為Vif對HIV-1感染很重要，這一發現與之前的實驗結果一致。
圖2 Vif調控宿主抗病毒轉錄過程
Vif與SHP-1相互作用抑制細胞因子的產生
免疫共沉淀、pull down、免疫熒光共聚焦顯微鏡檢測、制備突變體等實驗結果表明Vif通過ITIM與SHP-1相互作用，促進SHP-1的激活。通過基因敲除實驗的結果表明，Vif對細胞因子產生的抑制是由SHP-1介導的。
SHP-1與STING相互作用抑制k63連接的STING泛素化
熒光素酶實驗表明SHP-1抑制N-RIG-I-、MAVS-和sting誘導的IFN-β和ISRE的激活，但對TBK1和IRF3誘導的激活通路無影響。這表明SHP-1作用于TBK1-IRF3的上游(圖3A， B)。基于Co-IP的篩選顯示SHP-1能夠與STING相互作用(圖3C)，這在正向和反向Co-IP實驗中得到了證實(圖3D)。GST下拉實驗顯示，STING直接與來自腹膜巨噬細胞的His-SHP-1和內源性SHP-1結合(圖3E)。然而，磷酸酶缺陷SHP-1突變體不能與STING相互作用(圖3F)。STING的1-137氨基酸殘基和SHP1的243-595氨基酸殘基是它們相互作用的必要條件。在HEK293T細胞中過表達SHP-1，發現SHP-1抑制了STING的總泛素化和k63鏈接的泛素化，但對其他類型的泛素化無影響(圖3G)，而SHP-1(C453S)則沒有抑制活性。此外，SHP-1以劑量依賴性的方式抑制STING的低聚以及STING與TBK1之間的相互作用(圖3H， I)。相反，與野生型小鼠腹腔巨噬細胞相比，SHP-1缺乏的腹腔巨噬細胞(標記為mev/mev)中，STING更有效地與TBK1結合(圖3J)。
圖3 SHP-1與STING相互作用，抑制STING的激活
隨著進一步深入研究與探索，本研究依次得出如下重要結論：SHP-1通過去磷酸化Tyr162位點抑制k63連接的STING Lys337位點泛素化Vif，促進SHP-1對STING激活的抑制作用；ITIM磷酸化Vif對于Vif -SHP-1相互作用和細胞因子抑制至關重要；FRK是介導Vif抑制HIV-1感染過程中細胞因子產生的關鍵激酶。
研究結論
本研究中發現，Vif抑制I型IFN的產生以促進免疫逃逸。HIV-1感染誘導宿主酪氨酸激酶FRK激活，進而磷酸化Vif的ITIM，增強Vif與細胞酪氨酸磷酸酶SHP-1的相互作用抑制I型IFN。從機制上講，Vif與SHP-1的關聯促進SHP-1募集到STING，并通過去磷酸化STING的Tyr162位點抑制k63連接的STING在Lys337位點泛素化。FRK抑制劑D-65495可抑制Vif的磷酸化，阻斷HIV-1的免疫逃逸，拮抗感染。這些發現揭示了一個以前未知的機制，即HIV-1通過含有ITIM的蛋白質抑制STING的翻譯后修飾來逃避抗病毒免疫。這些結果為開發新的治療策略來治療HIV-1感染提供了分子基礎。
本研究的RNA測序和數據分析工作由上海派森諾生物科技有限公司完成。
