2021-12-08
期刊：《Frontiers in Genetic》
影響因子：4.599
技術手段：RNA-seq，qRT-PCR，LC-MS非靶向代謝
異齒裂腹魚屬于裂腹魚亞科魚類，藏語稱“棒棒魚”，是裂腹魚亞科中具有代表性的四倍體物種，主要分布于雅魯藏布江干流和支流中，屬于青藏高原重要的特有魚類。目前，由于河流筑壩和過度捕撈，裂腹魚類的野生資源已經呈逐年下降的趨勢。人工養殖親魚的培育是異齒裂腹魚野外資源恢復的有效手段之一，然而，在人工養殖條件下異齒裂腹魚不能進行正常的性腺發育和成熟，導致馴養條件下異齒裂腹魚的繁殖功能障礙。
多項研究表明，魚類繁殖功能障礙是由于人工養殖條件下的綜合應激，特別是脂肪酸、維生素等營養因素對卵細胞質量和繁殖功能起著重要作用，從營養組學的角度探究馴養條件下異齒裂腹魚繁殖功能障礙，以了解在人工馴養條件下對異齒裂腹魚卵母細胞和肝臟的影響，為獲得異齒裂腹魚的全人工繁育提供基礎數據。
圖1 野生和人工馴養條件下異齒裂腹魚的卵母細胞和肝臟
與野生組相比（圖1A,B），人工養殖條件下異齒裂腹魚的的卵巢中有許多閉鎖的卵母細胞，絨毛膜和卵泡的細胞層也有不規則的收縮和折疊（圖1C,D）。肝細胞在野生型中分布均勻(圖1E)，但在人工馴養條件下的細胞核是缺失的或被推到細胞邊緣，并且細胞質在肝臟內發生液化(圖1F)。
2. 代謝組學分析
圖2 差異代謝物統計和熱圖分析
利用LC-MS對代謝產物進行分析，共得到5129個離子峰。PCA、PLS-DA和OPLSDA結果顯示，野生組和人工養殖組的肝臟和卵母細胞均有明顯差異，反映出不同組間代謝差異顯著。所有樣本都在95%置信區間內。
與自建數據庫比對，共鑒定到233種代謝物。在卵母細胞中（OD和OW組）共有37個差異代謝物（18個下調，19 上調）。這些差異代謝物包括許多與卵巢發育相關的代謝物，如孕烯醇酮、前列腺素F3a (PGF3a)、花生四烯酸(ARA)、5 '-二磷酸腺苷(ADP)和一磷酸腺苷(AMP)。在肝臟中（LD與LW組）共有70個差異代謝物（45個下調，25個上調）。
KEGG富集分析顯示，卵母細胞中只有兩條通路顯著富集，即精氨酸、脯氨酸代謝和亞油酸代謝。肝臟中有五個顯著富集的通路包括不飽和脂肪酸的生物合成、嘧啶代謝、 ABC轉運蛋白、淀粉和蔗糖代謝以及脂肪酸的生物合成。
3. 轉錄組學分析
圖3 飽和曲線和熱圖分析
為進一步了解人工馴養條件下異齒裂腹魚的基因表達的變化，我們使用RNA-seq進行轉錄組學分析。經數據過濾后，共獲得658.68 M clean reads。飽和曲線分析表明，基因定量結果可靠(圖3A)。聚類熱圖分析顯示每個組的生物學重復基本聚在一起，表明組內重復性較好(圖3B,C)。
圖4 差異表達基因火山圖和熱圖分析
LD與LW組中共鑒定到2,841個差異基因(1,285個上調，1,556個下調)，OD與OW組中有159個差異基因(80個上調，79個下調)(圖4A-C)。
圖5 GO和KEGG富集分析
圖5展示了LD與LW組中前10個顯著富集的GO條目和通路，包括原核生物碳固定通路、PPAR信號通路配體-受體相互作用、丙酸代謝和碳代謝。而OD和OW組中只有一個GO 條目和通路顯著富集，即細胞生長和死亡通路。
圖6 RNA-seq和qRT-PCR的相關性分析
基于DEG富集分析結果，對與脂肪酸合成、不飽和脂肪酸合成、淀粉和蔗糖代謝相關的10個DEG (ACACA、ELOV6、FADS2、FAS、PGM1、SCD5、LYAG、G6PC3、HXK2和ACBG1)進行qRT-PCR驗證。結果顯示RNA-seq和qRT-PCR數據之間有很強的相關性，表明RNA-seq數據的可靠性(圖6)。
4. 代謝組和轉錄組聯合分析
圖7 聯合分析
代謝組學和轉錄組學數據的比較表明，肝臟中存在三個共同的顯著富集通路，即不飽和脂肪酸的生物合成、淀粉和蔗糖的代謝和脂肪酸的生物合成，多個代謝物-基因對與5 '-二磷酸腺苷、一磷酸腺苷和孕烯醇酮有關，這些研究結果表明，在異齒裂腹魚的人工養殖中應特別注意脂肪酸的組成和攝入量。
結論
本研究首次對野生和馴養異齒裂腹魚的肝臟和卵母細胞進行組織學比較，并通過代謝組和轉錄組學的聯合研究。文章綜述了人工養殖過程中肝臟和卵母細胞代謝和轉錄組的變化。在卵母細胞中，一些差異代謝物和基因與孕激素介導的卵細胞成熟通路有關。在肝臟中，差異代謝物和基因在不飽和脂肪酸合成、淀粉和蔗糖代謝和脂肪酸合成通路顯著富集，表明這些可能是人工養殖過程中的關鍵代謝通路，為獲得異齒裂腹魚的全人工繁育提供基礎數據。
本研究的RNA-seq和LC-MS均由上海派森諾生物科技有限公司完成。
