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細(xì)菌完成圖+比較基因組分析再添好文！

2021-12-08

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期刊：《Frontiers in Microbiology》

影響因子：5.640


近日，派森諾生物與上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院合作，在微生物基因組領(lǐng)域《Frontiers in Microbiology》發(fā)表研究成果！本文首次報(bào)道一種新型假單胞菌1257菌株，該菌株可以有效抑制水稻黃單胞菌（xanthomonasoryzae，Xoc）在水稻中的生長和遷移，從而預(yù)防細(xì)菌性葉斑病(bacterial leaf streak，BLS)。

研究背景

假單胞菌是普遍存在于土壤、水、動(dòng)物和植物根際的革蘭氏陰性菌，其具有生長速度快并在植物根際持續(xù)存在的能力，能夠產(chǎn)生廣泛的次生代謝產(chǎn)物(如抗生素、鐵載體、揮發(fā)物和促生長物質(zhì))從而適應(yīng)環(huán)境脅迫，適合作為植物病原生物防治劑。假單胞菌屬的某些種已被證明是有效的生物防治或生長促進(jìn)劑，人們對(duì)該菌在商業(yè)和生物技術(shù)上的應(yīng)用越來越感興趣。

水稻黃單胞菌(Xoc)可通過侵染寄主水稻引起細(xì)菌性葉斑病(BLS)，該病已逐漸成為我國南方部分水稻產(chǎn)區(qū)第四大病害，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致減產(chǎn)10-30%。到目前為止，還沒有發(fā)現(xiàn)對(duì)Xoc完全免疫的水稻品種。目前，我國普遍種植的水稻品種均對(duì)弓形蟲敏感，甚至一些雜交水稻品種也是高度敏感的，目前我國常用殺菌劑如雙美噻唑的使用，導(dǎo)致Xoc產(chǎn)生耐藥性，因此，急需一種有效的、環(huán)境友好的生物防治方法。

本研究從223株候選菌株中鑒定了一株假單胞菌1257菌株，系統(tǒng)發(fā)育、基因組學(xué)和生理生化特征表明1257菌株是一種具有代表性的新型假單胞菌。此菌是首次報(bào)道的一種新型假單胞菌可能對(duì)BLS生物防治具有較大作用。


研究材料與方法

1、實(shí)驗(yàn)材料：上海市奉賢區(qū)莊航村古村采集的卷心菜根際土壤中分離得到的菌株1257；

2、測(cè)序平臺(tái)：Illumina Miseq 、Pacbio

3、分析內(nèi)容：細(xì)菌完成圖測(cè)序、系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建、ANI分析、基因家族分析、共線性分析、次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇預(yù)測(cè)分析等。

研究結(jié)果

1、1257菌株分離和鑒定

在233株分離菌株中，發(fā)現(xiàn)其中一株1257菌株對(duì)Xoc RS105具有較強(qiáng)的抑制作用(抑制帶> 40 mm)，另外8株Xoc分離自中國主要水稻產(chǎn)區(qū)(圖1A)。擴(kuò)增1257菌株的16S rRNA基因，將其與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)1257菌株屬于假單胞菌屬，1257菌株的16S rRNA基因序列與P. entomophila L48(99.54%)和P. mosselii CFMT90-83(99.48%)的序列相似度均超過99%。為了確定1257菌株的系統(tǒng)發(fā)育情況，對(duì)該菌株的全基因組進(jìn)行了測(cè)序(圖1B)。根據(jù)MLSA（MLSA分析使用的基因?yàn)?0個(gè)管家基因，分別為16Sr RNA、aroE、dnaA、guaA、gyrB、mutL、ppsA、pyrC、recA和rpoB）分析結(jié)果顯示，1257菌株位于一個(gè)單獨(dú)的分支，其最接近的是P. entomophila L48和P. mosselii型株CFMT90-83(圖1C)。ANI分析發(fā)現(xiàn)，該菌株與已知菌種見的ANI值在73.77~89.13%之間，表明該菌株是一個(gè)新種。

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圖 1 |菌株 1257 的分離、鑒定和抗菌活性測(cè)定；（A）菌株 1257 的菌落形態(tài)和拮抗活性；(B) 菌株 1257完成圖；(C) 菌株 1257 的基于 MLSA 的系統(tǒng)發(fā)育樹。


2、1257菌株基因組特征和比較基因組分析

對(duì)菌株1257進(jìn)行高通量測(cè)序，得到一條6,049,604bp的染色體，GC含量為63.76%，預(yù)測(cè)得到5,411個(gè)編碼基因、22個(gè)rRNA、76個(gè)tRNA和73個(gè)其他ncRNA，該菌株的基因組和P. entomophila L48的親緣關(guān)系最近。從基因組大小上來看，菌株1257的基因組比P. entomophila L48大，比P. mosselii CFML90-83小。對(duì)這三個(gè)基因組進(jìn)行共線性分析和基因家族分析：1.共線性分析發(fā)現(xiàn)菌株1257與P. entomophila L48的親緣關(guān)系最近；2.基因家族分析發(fā)現(xiàn)這三個(gè)菌株的核心基因組由11791個(gè)基因組成，占每個(gè)基因組的83.6 ~ 87.1%(圖2C)，根據(jù)此分析發(fā)現(xiàn)菌株1257有957個(gè)基因家族是其特有的。

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圖2  P. oryziphila 1257 與其密切相關(guān)的兩個(gè)假單胞菌物種的比較基因組學(xué)分析和抗菌表型。(A)拮抗實(shí)驗(yàn)； (B)共線性分析；(C)基因家族分析。


3、次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇分析

antiSMASH分析顯示P. oryziphila 1257的基因組包含8個(gè)編碼二肽Nacetylglutaminylglutamine amidc (NAGGN)的候選基因簇、4個(gè)非核糖體肽合成酶(NRPS)和2個(gè)核糖體合成的抗微生物肽，芳基多烯(APE)型色素。Blast比對(duì)結(jié)果表明，在P. oryziphila、P. entomophila和P. mosselii基因組中，NAGGN、NRPS 3、APE和NRPS 4基因簇是保守的，而P. entomophila的次生代謝產(chǎn)物生物合成候選基因簇比P. oryziphila和P. mosselii多。

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圖3 次生代謝物生物合成基因簇比較。


4、Xoc抗菌機(jī)制的全基因組鑒定

Southern blot分析表明，所有突變體只攜帶一個(gè)轉(zhuǎn)座子副本。將Tn5轉(zhuǎn)座子插入到1257基因組13個(gè)不同區(qū)域的19個(gè)基因中，包括carAB、purMF、purCLDK、gntR-lgrD、sdhA、dsbB1、tuf1、serC、gph、dnaK、argG、sohB和rna2(圖4A)。作者構(gòu)建了carA、carB、purF和serC基因的完整功能片段，并將相關(guān)質(zhì)粒導(dǎo)入相應(yīng)的插入突變體中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，互補(bǔ)菌株對(duì)Xoc RS105的拮抗活性恢復(fù)到野生型水平(圖4B)，表明這些基因在生物合成抗Xoc RS105活性化合物中起著關(guān)鍵作用。

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圖4 |全基因組鑒定P.oryziphila 1257對(duì)Xoc RS105的抗菌功能基因。(A) P. oryziphila 1257的Tn5插入突變體特征。(B)野生型P. oryziphila 1257、carA、carB、purF、serC和lgrD突變體及其互補(bǔ)菌株的抑菌活性測(cè)定。

為了明確上述功能基因所涉及的代謝過程，對(duì)其進(jìn)行了KEGG注釋分析。carA和carB基因編碼氨基甲酰基磷酸酯合成酶，該酶催化氨基甲酰基磷酸酯(CP)的合成，是精氨酸和嘧啶代謝的前體。ArgG基因編碼的ArgG是一種精氨酸琥珀酸合成酶，負(fù)責(zé)從天冬氨酸中產(chǎn)生精氨酸琥珀酸。sdhA基因編碼琥珀酸脫氫酶a亞基，是三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶。這六個(gè)pur基因編碼（PurF、PurD、PurL、PurM、PurC和PurK）是PPP中的代謝酶，將糖酵解途徑(PP)中的核糖- 5p轉(zhuǎn)化為5-羧基氨基-1-(5-磷酸- dribosyl)咪唑(CPR)。這些分析表明，CP和CPR可能是合成活性化合物的重要前體，也為進(jìn)一步鑒定目標(biāo)化合物提供了重要的依據(jù)。

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圖 5  P. oryziphila 1257抗菌活性相關(guān)基因的KEGG分析示意圖。


5、稻瘟桿菌1257對(duì)細(xì)菌性葉斑病的生防效果

為研究水稻1257對(duì)Xoc RS105引起的BLS的生防效果，采用高感品種元豐早進(jìn)行了田間試驗(yàn):僅Xoc RS105(對(duì)照)，1257在Xoc RS105懸浮液(1257- tre)接種后12 h噴施，1257在Xoc RS105懸浮液(1257- pre)接種前12 h噴施。15天后調(diào)查BLS疾病嚴(yán)重程度：與對(duì)照處理相比，1257- tre和1257- pre預(yù)處理顯著降低了稻田BLS的嚴(yán)重程度，相對(duì)防治效率分別為53.9%和39.7%。結(jié)果表明，1257-Tre處理具有較好的田間生物防治效果。

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圖6 P. oryziphila 1257對(duì)水稻BLS的生防效果。（A)P. oryziphila 1257和Xoc RS105菌在15天田間試驗(yàn)中對(duì)水稻易感品種元豐早的病斑長度。(B)P. oryziphila 1257和Xoc RS105接種元豐早在溫室1、3、5和7天的病斑長度。(C)接種后1、3、5和7天，通過GUS定量檢測(cè)和組織化學(xué)染色監(jiān)測(cè)Xoc RS105-Gus在水稻葉片中的動(dòng)態(tài)種群數(shù)量。


研究結(jié)論

1、鑒定了一種新的假單胞菌(P. oryziphila)1257菌株，它具有抑制Xoo和Xoc的能力，特別是抑制Xoc在水稻組織中的生長和遷移，從而預(yù)防BLS病；

2、基因組信息顯示，該菌可能具有殺死昆蟲、溶解磷酸鹽、依賴T4P系統(tǒng)移動(dòng)、降解IAA和PAA等功能基因，是一種萬能菌；

3.在假單胞菌(P. oryziphila)1257菌株中發(fā)現(xiàn)一種非核糖體肽，該非核糖體肽可能是參與BLS生物防治的主要活性化合物；

綜上所述，假單胞菌(P. oryziphila)1257菌株的發(fā)現(xiàn)為水稻細(xì)菌性病害的生物防治提供了新的微生物資源。





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