2021-11-23
期刊：《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》
影響因子：5.239
派森諾與福建醫科大學附屬協和醫院李彬老師課題組合作，在微生物基因組領域的《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》發表新研究成果！本研究針對頭孢他啶/阿維巴坦（CAZ/AVI）耐藥和敏感的碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌進行研究，利用基因組和分子遺傳學方法鑒定和驗證了產生CAZ/AVI耐藥性的原因。
研究背景
耐碳青霉烯腸桿菌科（CRE）的出現和流行引起了廣泛關注，其中碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌（CR-KP）是世界上非常常見的。CR-KP可導致多種感染，如肺炎、血液感染和尿路感染，導致了高發病率和死亡率。多粘菌素、替加環素、氨基糖苷類和磷霉素這些抗生素因為有效性和安全性的限制，致使CR-KP感染的患者幾乎沒有有效的治療選擇。
頭孢他啶/阿維巴坦（CAZ/AVI）是頭孢他啶和β-內酰胺酶抑制劑阿維巴坦的新組合，具有抗A、C類和一些D類碳青霉烯酶的活性，是目前治療肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的一種有價值的替代策略。但CAZ/AVI對B類碳青霉烯酶沒有活性，如NDM。到目前為止，全球共檢測到31個突變體，在這些突變體中NDM-5于2011年在英國的大腸桿菌中被首次發現，并因其迅速傳播而引起了全世界的關注。此外，從人類、動物和醫院環境的污水中也都發現產生NDM-5腸桿菌菌株，與其他突變體一樣，NDM-5可導致CAZ/AVI耐藥性。許多研究發現在CAZ/AVI治療過程中發生抗性，例如blaKPC突變、基因拷貝數增加和基因過表達等，但是在CAZ/AVI治療過程中獲得NDM基因的病例尚未見報道。在本研究中，報道了治療KPC-2肺炎克雷伯菌的過程中，由于NDM基因而導致CAZ/AVI耐藥的出現，并利用基因組和分子遺傳學方法鑒定和驗證了產生CAZ/AVI耐藥性的原因。
研究材料與方法
實驗材料：
福建醫科大學協和醫院分離到的耐CAZ/AVI和CAZ/AVI敏感的碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌。
測序平臺：
Illumina NovaSeq
分析內容：
細菌框架圖測序、接合實驗和質粒穩定性實驗、藥敏實驗、基因克隆和qPCR實驗等。
研究結果
病例報告
在一次交通事故后，一名67歲男子因肺部感染住進ICU，支氣管鏡下痰培養后開始用替加環素和多粘菌素治療產生了CR-KP菌株。然而，經支氣管鏡檢查痰培養的菌株在治療16天后仍然為CP-KP（KP135194）陽性，對CAZ/AVI敏感，對碳青霉烯類抗生素耐藥。對患者進行CAZ/AVI治療11d，在結束治療的7d后檢測顯示KP135194再次呈現陽性，并且對CAZ/AVI和碳青霉烯類抗生素均耐藥。另外，在KP135194和KP137060之間未分離到其他CR-KP菌株。在入院第19d、21d、37d和42d，在支氣管鏡檢查后痰培養中均發現了嗜麥芽窄食單胞菌，患者隨后出院并轉往另一家醫院。微生物學細節、時間表和使用的抗生素治療如圖1所示。
圖1 CR-KP感染和治療的時程分析
碳青霉烯類基因克隆和藥敏實驗
ERIC-PCR分析表明，兩株CR-KP分離株具有克隆性關系。KP137060菌株對CAZ/AVI和TGC的MIC值均高與KP135194菌株，MEM、ETP和IMP的MIC相同。兩種CP-KPs的藥敏圖譜如表1所示。克隆實驗在兩個分離株中都檢測到blaKPC-2基因，在菌株KP137060中檢測到了blaNDM-5基因。
表1 藥敏實驗結果
blaKPC-2,ompK35和ompK37基因的突變和表達研究
PCR擴增和一代測序結果表明，在兩株CR-KP分離株中均未發現blaKPC-2基因突變 。使用Resfinder檢測ompK35和ompK37也未發現突變，同時ompK36在兩株分離株中并未檢測到。而blaKPC-2、ompK35和ompK37在兩個分離株的表達差異無統計學差異。
表2 兩株CR-KP菌株的遺傳特性及來源
接合實驗、質粒穩定性檢測和成本評估實驗
在研究中發現blaNDM-5基因以1.14x10-4的接合頻率成功地轉入大腸桿菌J53，而blaKPC-2則失敗了，但在PCR檢測中證實了blaKPC-2和blaNDM-5的存在。受體細胞和接合子的藥敏試驗結果如表1所示。質粒穩定性試驗表明，攜帶質粒blaKPC-2和blaNDM-5的質粒在CR-KP中仍能穩定存在150代，而兩株CR-KP菌株的生長沒有顯著差異。體外生長競爭實驗結果表明，其相對適宜成本為1.01。
全基因組測序和分析
MLST分析發現這兩株CR-KP分離株菌株ST11型，含有β-內酰胺酶基因。全基因組分析表明，KP135194和KP137060菌株高度同源，ANI值為99.99%。核心基因組SNPs分析結果表明，兩個菌株的核心基因組中存在23個非同義SNPs。在本研究中，KP137060菌株含有blaNDM-5基因。表2中還檢測到其他抗性基因，如rmtB、foA、catA2、sul2、tet(A)和dfrA14基因；毒力基因（rmpA和rmpA2）與超強毒力K相關的莢膜類型（K1和K2）基因相關的hvKp并未檢測到。
圖2：質粒圖譜
與菌株KP135194相比，KP135194菌株多了一個IncX3質粒。此外，全基因組測序結果表明blaKPC-2(IncFII/IncR)和blaNDM-5(IncX3)分別位于兩個不同的質粒上，blaKPC-2和blaNDM-5質粒的全核苷酸序列及質粒大小如圖2所示。關于blaKPC-2基因的遺傳環境，blaKPC-2基因上游有Tn1331元件，下游有一個可能的ISKpn6類似元件，緊隨其后的是korC基因，一個編碼假定蛋白基因和一個klcA基因。對于blaNDM-5基因則定位于IS26元件、編碼雙精氨酸轉位途徑信號序列域蛋白的基因、編碼假定蛋白的基因和編碼磷酸化氨基硅酸異構酶基因trpF之間。此外，還有一個IS5元件位于blaNDM-5下游。
研究結論
本研究發現，產KPC-2肺炎克雷伯菌在治療過程中產生了攜帶blaNDM-5的質粒，導致對CAZ/AVI耐藥性。同時攜帶NDM-5的質粒具有可轉移性，接合頻率為1.14x10-4。此外，在攜帶blaNDM-5的質粒上沒有發現明顯的適合性成本。因此，通過細菌培養和藥敏試驗仔細監測耐藥性的發展是重要的，并且需要持續監測以避免CAZ/AVI的CR-KP傳播。
本研究的denovo測序和部分數據分析由上海派森諾生物科技有限公司完成。
