2021-11-16
期刊：《Scientific Reports》
影響因子：4.379
派森諾與江西農業大學張錦華老師課題組合作，在微生物基因組領域的《Scientific Reports》發表研究成果！該研究從腹瀉仔豬的腸道內容物中分離得到了一株A型的產氣莢膜梭菌JXJA17，對其進行了全基因組測序和比較基因組分析，為進一步研究β2毒素與仔豬腹瀉的關系提供了依據。
01、研究背景
產氣莢膜梭菌（C. perfringens，Cp）是一種普遍存在的革蘭氏陽性桿狀厭氧細菌，根據其產生的四種毒素，將其分為A-F七種類型。Cp是人類和動物的常見病原體，是一種條件致病菌，會導致氣體壞疽、腹瀉和食物中毒等疾病發生，并生成相關的毒素和毒力因子（A-F型的Cp產生的毒素超過18種）。CpA主要由兩個cpb2等位基因編碼產生α毒素和β2毒素（β2毒素分為兩類：典型和非典型），而典型β2毒素被認為和從豬上分離得到的C. perfringens有關，但是關于CpA β2毒素的發病機制及CpA的全基因組研究較少。
本研究從腹瀉仔豬的腸道內容物中分離得到229株Cp，經毒素分型鑒定為CpA。根據小鼠毒性實驗和兔子回腸實驗發現，該菌株攜帶cpb2基因，且比不攜帶cpb2基因的健康仔豬分離到的CpA具有更高的致病性。為了更好地鑒定腹瀉仔豬CpA的β2毒素，故對C. perfringens JXJA17菌株進行了全基因組測序，并對cpb2基因進行了分析。
02、研究材料與方法
1.實驗材料：腹瀉仔豬的腸道內容物中分離得到的A型C. perfringensJXJA17菌株
2.測序平臺：Illumina Miseq+Pacbio
3.分析內容：細菌完成圖測序、毒力和耐藥基因分析、進化樹構建、共線性分析
03、研究結果
1.菌株JXJA17的基因組特征
本次測序采用了Illumina Miseq和Pacbio Sequel平臺進行高通量測序，其中Illumina Miseq平臺測序得到了5,250,394條高質量reads和1,283,480,560bp的高質量數據，Pacbio Sequel平臺得到了163,553條reads和1,302,938,004bp數據量，測序的GC含量為32.67%，本次測序基因組的測序深度為357X。菌株JXJA17的全基因組測序組裝后得到1條染色體和9個質粒，染色體的長度為3,324,072bp，GC含量為28.51%，基因預測得到2967個ORF，30個rRNA和95個tRNA（圖1）。剩下9個質粒的JXJA17_p1-JXJA17_p9的質粒大小分別為58,796bp、38,284bp、62,027bp、40,125bp、36,275bp、12,326bp、12,133bp、3,550bp和11,801bp，非編碼RNA預測發現JXJA17_p2攜帶一個tRNA和一個ncRNA外，其余質粒均不攜帶rRNA、tRNA和其他ncRNA。CRISPR預測得到一個CRISPR結構，該序列長2,865bp，重復了44次，由43個間隔序列，其中每個重復長度為26bp，間隔序列的平均長度為29bp。
圖1：菌株JXJA17染色體基因組圈圖
對菌株JXJA17基因組進行COG注釋，結果發現由7個分類占比較大，分別是：R（功能預測，268個ORFs，9.03%）；G（碳水化合物運輸和代謝，199個ORFs，6.71%）；S（未知功能，192個ORFs，6.47%）；E(氨基酸運輸和代謝，180個ORFs, 6.07%)、L(復制、重組和修復，169個ORFs, 5.70%)、J(翻譯、核糖體結構和生物發生，160個ORFs, 5.39%)、K(轉錄，160 orf, 5.39%)。
2. 菌株JXJA17基因組同源性分析
圖2：菌株JXJA17和NCBI上所有205株Cp菌株的全基因組進化樹
基于菌株JXJA17和NCBI上已報道的所有205株Cp菌株的全基因組進行進化樹構建，結果表明菌株JXJA17與JGS1495、Cp-06和Cp-16的親緣關系更近，但是這3個菌株均未組裝成完成圖。基于JXJA17和19個Cp菌株的16s和管家基因構建進化樹，結果表明JXJA17與Cp FORC_003的親緣關系更近。分別對這五個菌株的基因組特征進行比較，結果發現菌株JXJA17和其他4株菌的遺傳背景和毒素類型均不相同。
表1：基因組一般特性比較
3. 菌株JXJA17中攜帶cpb2基因質粒的共線性分析
圖3：攜帶cpb2基因的Cp菌株的共線性分析
測序結果顯示典型cpb2基因位于菌株JXJA17_p1上，不與其他毒素（如腸毒素和ε毒素）基因和耐藥基因共存。和其他攜帶cpb2的質粒相比，JXJA17_p1沒有Tcp結合位點或插入序列（圖3和表2）。對攜帶cpb2基因的質粒進行共線性分析，結果顯示這些質粒上的基因可以分為8個不同的模板，其中cpb2基因位于藍色區域（圖4）。
表2：NCBI中攜帶beta2毒素的質粒的一般特性分析
圖4：共線性分析
4. 毒力基因和耐藥基因分析
對菌株JXJA17基因組進行VFDB分析發現該菌株的染色體和質粒上攜帶一些重要的致病和毒力相關基因。其中發現了10個已知的毒力相關基因，如α毒素磷脂酶C基因和β2毒素基因。其他毒力因子包括產氣莢膜溶解素O、巰基激活的細胞溶解素、膠原酶等等。CARD分析，得到了21個抗生素抗性基因和18個抗生素靶點相關基因，表明該菌株可能對氟諾喹酮類、達托霉素、四環素、鏈霉素和紅霉素產生耐藥性。其中JXJA17_p1上未攜帶耐藥基因和其他毒性相關基因。
04、研究結論
1.對產氣莢膜梭菌菌株JXJA17進行全基因組測序，得到1條染色體和9個質粒；
2.16s進化樹和全基因組進化樹分析表明，菌株JXJA17與JGS1495、Cp-06、Cp-16和Cp FORC_003具有較高的同源性，但這些分離株的遺傳背景和毒素類型均不相同；
3. 編碼β2毒素的cpb2基因位于JXJA17_p1上，該質粒不攜帶其他毒力基因、耐藥基因和插入序列。該質粒不攜帶Tcp，但含有Pcp偶聯位點，是產氣莢膜梭菌中的一個新的偶聯毒素質粒家族；
綜上所述，對菌株JXJA17的全基因組及cpb2基因的同源性分析，有助于進一步研究β2毒素與仔豬腹瀉的關系。
本研究的denovo測序和部分數據分析由上海派森諾生物科技有限公司完成。
