2021年11月2日，派森諾與上海中醫(yī)藥大學(xué)黎萬(wàn)奎老師課題組，在微生物基因組領(lǐng)域的《Pathogens》發(fā)表研究成果！該研究從藏紅花的根際土壤中分離得到了銅綠假單胞菌YY322，通過(guò)拮抗實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)藏紅花的病原菌具有較強(qiáng)的拮抗，全基因組測(cè)序揭示了該菌株在植物生長(zhǎng)促進(jìn)和生物防治機(jī)制中的作用，為銅鋁假單胞菌作為植物促生菌用于藏紅花生產(chǎn)提供了證據(jù)，為微生物肥料的開(kāi)發(fā)利用奠定了理論基礎(chǔ)。
藏紅花是中國(guó)一種重要的藥用植物，具有活血化瘀、涼血解毒、緩解抑郁、鎮(zhèn)定神經(jīng)的功效。由于藏紅花產(chǎn)量低、價(jià)值高、價(jià)格昂貴、被稱為“紅色黃金”。目前上海崇明島可以廣泛種植藏紅花，但由于長(zhǎng)期連作等因素，許多球莖已經(jīng)腐爛，導(dǎo)致藏紅花產(chǎn)量和質(zhì)量下降。有研究表明，植物根際土壤環(huán)境獨(dú)特，大量微生物聚集在該區(qū)域，為植物的生長(zhǎng)發(fā)揮著重要作用。從根據(jù)土壤中目前已經(jīng)分離除大量具有增長(zhǎng)植物養(yǎng)分吸收和免疫功能的植物促生菌（PGPR），其中假單胞菌是一種廣泛分布于自然界的專性需氧革蘭氏陰性桿狀細(xì)菌，其生長(zhǎng)迅速，能適應(yīng)自然環(huán)境，而且還能分泌一系列代謝物，有效地拮抗植物病原體的發(fā)生和發(fā)展，幫助植物吸收和利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。本研究從藏紅花根際土壤中分離得到了85株細(xì)菌，其中YY322菌株對(duì)藏紅花5種病原菌具有較好的拮抗作用，結(jié)合生理生化試驗(yàn)和分子生物學(xué)鑒定，確定該菌為銅綠假單胞菌。通過(guò)全基因組測(cè)序分析，進(jìn)一步探索其拮抗和促生長(zhǎng)機(jī)制。
1.實(shí)驗(yàn)材料：藏紅花根際土壤中分離得到的通路假單胞菌YY322分離株
2.測(cè)序平臺(tái)：Illumina Novaseq+Pacbio
3.分析內(nèi)容：細(xì)菌完成圖測(cè)序、16S進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建、次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇分析、菌株形態(tài)和生理生化實(shí)驗(yàn)等。
從藏紅花根際土壤中分離得到85株細(xì)菌，經(jīng)過(guò)多次篩選，菌株YY322的拮抗效果最好，對(duì)尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）、茄病鐮刀菌（F.solani）、檸檬黃青霉（P.citreosulfuratum,）、橘青霉(P.citrinum)和唐菖蒲菌(S.gladioli)的抑制率分別為73.17%、62.20%、23.16%49.17%和79.76%。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不僅病原菌的生長(zhǎng)受到了明顯的抑制，菌株YY322的形態(tài)特征與正常狀態(tài)相比也發(fā)生了明顯的變化，這表明該菌株可能產(chǎn)生了一些未知的抗真菌物質(zhì)。
圖1：菌株YY322對(duì)PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)1 ~ 2周的5種病原菌的拮抗作用
SEM顯示，在菌株YY322作用下，鐮刀菌菌絲和分生孢子與對(duì)照組相比發(fā)生了顯著變化。對(duì)照組菌絲圓潤(rùn)飽滿、形態(tài)結(jié)構(gòu)完整、表面光滑、厚度均勻；分生孢子正常紡錘形，中等大小、顯示出良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。菌株YY322侵染的F.oxysporum菌絲大量斷裂、菌絲表面凹凸不平，切分嚴(yán)重，頂端發(fā)育異常，分生孢子畸形。菌株YY322侵染F.solani后，菌絲嚴(yán)重受損，表面收縮，內(nèi)容物滲漏。
圖2：掃描電鏡下菌絲和分生孢子形態(tài)變化的觀察
TEM顯示，對(duì)照組菌絲分布均勻，菌絲呈規(guī)則圓形，菌絲邊界清晰。細(xì)胞壁和細(xì)胞膜保持完整致密，細(xì)胞質(zhì)分布均勻，維持正常生長(zhǎng)狀態(tài)。與對(duì)照組相比，菌株YY322作用下鐮刀菌的內(nèi)部結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重破壞。菌株YY322侵染的F.oxysporum菌絲細(xì)胞壁破裂，導(dǎo)致內(nèi)容物外泄，液泡數(shù)量減少、體積增大，胞漿渾濁、混亂。侵染的F.solani表現(xiàn)出大量未成熟分生孢子聚集在一起，菌絲切片形狀異常。細(xì)胞壁增厚，胞漿混合呈黑色，液泡幾乎消失。
圖3：透射電鏡（TEM）下觀察菌絲內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化
3.菌株YY322揮發(fā)性有機(jī)物（VOCs）對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制作用
在菌株YY322的培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)該菌株可以產(chǎn)生一種特殊的氣味，故測(cè)試了其VOCs的抗真菌作用，結(jié)果表明它對(duì)F.oxysporum和F.solani有明顯的抑制作用，抑制率分別為90.24%和89.02%。有趣的是，仍然可以觀察到兩種病原體的少量菌絲擴(kuò)散到整個(gè)平板(圖4)。
圖4：VOCs的抗真菌活性:(A)尖孢鐮刀菌;（B）番茄鐮刀菌(1)對(duì)照組;(2)實(shí)驗(yàn)組。
4.菌株YY322的形態(tài)鑒定和生理生化實(shí)驗(yàn)
菌株YY322在30℃下孵育24h后LB培養(yǎng)基上的單個(gè)菌落幾乎是圓形的，相對(duì)扁平，淺黃綠色，不光滑，不透明，邊緣不規(guī)則(圖5A)。SEM觀察到菌株YY322呈棒狀，大小約為0.5μm × 2μm(圖5B)。隨后，菌株YY322根據(jù)其16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖6)鑒定為P. aeruginosa，保存在GenBank中，登錄號(hào)為MZ026485，最后通過(guò)生理生化試驗(yàn)確認(rèn)菌株YY322為P. aeruginosa。
圖5：YY322菌株的形態(tài):(A)菌落形態(tài);(B)微觀形態(tài)
圖6：YY322菌株16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)
表1：菌株YY322的形態(tài)、生化、植物促生和拮抗活性
對(duì)菌株YY322進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株：1.表現(xiàn)出較強(qiáng)的蛋白酶活性和較弱的葡聚糖酶活性，但纖維素酶和幾丁質(zhì)酶活性缺乏；2.能固定氮，溶解有機(jī)磷酸鹽和無(wú)機(jī)磷酸鹽，產(chǎn)生鐵載體和NH3，但不溶解鉀，不產(chǎn)生IAA和ACC脫氨酶。
全基因組測(cè)序得到一條環(huán)狀的、大小為6382345bp、GC含量為66.47%的染色體，預(yù)測(cè)得到了5809個(gè)編碼基因、64個(gè)tRNA、12個(gè)rRNA、75個(gè)其他ncRNA和7個(gè)CRISPR結(jié)構(gòu)。在GO、KEGG、eggNOG數(shù)據(jù)庫(kù)分別預(yù)測(cè)到了4377、3192和5254個(gè)編碼基因。GO注釋得到的途徑包括生物過(guò)程、分子功能、細(xì)胞、生物合成過(guò)程、細(xì)胞氮化合物代謝過(guò)程、細(xì)胞成分和離子結(jié)合。eggNOG分類注釋顯示，90.45%的蛋白編碼基因可以被注釋到，有555個(gè)基因未被注釋到。其中轉(zhuǎn)錄基因最為豐富，有455個(gè)，占7.83%；其次是調(diào)節(jié)氨基酸運(yùn)輸和代謝的基因有436個(gè)，占7.51%。KEGG通路的8種分類中，其中蛋白家族:信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞過(guò)程、遺傳信息處理、代謝)中包含的基因數(shù)量最多，其次是代謝相關(guān)的通路(氨基酸和碳水化合物代謝)。
圖8：各個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋結(jié)果
CAZymes分析表明糖基轉(zhuǎn)移酶(GTs;40個(gè)基因)家族是主要分類，其次是碳水化合物酯酶(CEs;34個(gè)基因)和糖苷水解酶(GHs;33個(gè)基因)。antiSMASH分析結(jié)果表明，菌株YY322編碼15個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇(BGCs)，包括4個(gè)NRPS、2個(gè)NRPS-like、2個(gè)RiPP、2個(gè)phenazine、一個(gè)T1PKS、一個(gè)T3PKS、一個(gè)氧化還原輔助因子、一個(gè)硫肽類和一個(gè)倍他內(nèi)酯。其中3個(gè)與編碼coelibactin、綠膿菌青素和l -2-氨基-4-甲氧基-反式-3-丁烯酸的基因具有100%的相似性(表2)
表2：菌株YY322的次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)
1.研究發(fā)現(xiàn)通路假單胞菌可以作為藏紅花病原菌的生防劑，初步試驗(yàn)表明其具有PGPR性狀；
2.本研究首次報(bào)道了銅綠假單胞菌對(duì) P. citreosulfuratum, P. citrinum和S. gladioli具有拮抗作用。
綜上所述，認(rèn)為菌株YY322可以發(fā)展成為藏紅花微生物肥料，后續(xù)會(huì)繼續(xù)通過(guò)室內(nèi)和田間試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證菌株YY322的拮抗和PGPR作用。
本研究的denovo測(cè)序和部分?jǐn)?shù)據(jù)分析由上海派森諾生物科技有限公司完成。
