2021-11-03
影響因子：4.096
文章題目：Tandem Mass Tag-Based Quantitative Proteomic Analysis of ISG15 Knockout PK15 Cells in Pseudorabies Virus Infection
技術手段：TMT標記定量蛋白組學
派森諾生物與河南農業大學攜手合作，于近期在《Genes》上發表了通過蛋白質組學分析PRV和宿主細胞相互作用分子機制的研究成果。
豬偽狂犬病（Pseudorabies virus，PRV）是一種主要發生在豬身上的急性傳染病，對全球養豬業造成了嚴重的威脅?，F有的商業疫苗也未能防止新的PRV菌株出現。因此，迫切需要新的手段和策略來控制PRV的傳播。
迄今為止，應用蛋白質組學來分析PRV-宿主細胞互作機制的研究還很少。因此本文采用TMT標記定量蛋白質組學方法來比較PRV感染后宿主細胞的蛋白表達差異，為進一步揭示PRV發病機制和潛在的抗病毒靶點提供理論依據。
技術線路
1、PRV誘導的細胞蛋白表達差異
為了分析PRV感染過程中宿主細胞蛋白表達量的變化，本文對ISG15-/--PK15細胞（ISG15敲除的PK15細胞）進行蛋白質組學分析(圖1A)。在PRV和Mock比較組中，共鑒定出4958個肽段，篩選出241個差異表達蛋白（差異倍數＞1.2或＜0.83，P值<0.05），與Mock組相比，PRV感染的ISG15-/--PK15細胞中有162個差異蛋白顯著上調，79個差異蛋白顯著下調 (圖1B)。
圖1 火山圖和聚類熱圖
2、RT-qPCR和Western Blot驗證
為確保蛋白質組學數據的可靠性，隨機選取8個蛋白(AFP、Hsp40、Herc5、Mcc1、Vtn、Strap、Fn1和IL18)進行RT-qPCR和Western blot驗證。此外，選擇PRV-gE蛋白用于驗證PRV復制。如圖2所示，RT-qPCR和Western blot結果與TMT定量蛋白質組學一致(圖2)。以上結果表明，使用TMT標記方法篩選的DEP具有很高的可信度。
圖2 RT-qPCR和Western blot驗證
3、差異蛋白的GO富集分析
GO功能可分為生物過程(BP)、細胞成分(CC)和分子功能(MF)三個部分。對差異表達蛋白進行GO富集分析，在生物過程中，差異蛋白主要在單一的生物過程、代謝進程、免疫系統進程、多細胞進程、發育進程富集。在細胞組成中主要富集到細胞部分、細胞器、胞外基質、超分子纖維、細胞連接等term。在分子功能中，差異蛋白在結合活性、催化活性、分子功能調節因子、結構分子活性、轉運活性和抗氧化活性均顯著富集(圖3)。
圖3 GO富集分析
4、差異蛋白的KEGG富集分析
KEGG富集分析結果表明，241個差異表達蛋白顯著富集在7個通路，包括PI3K-Akt信號通路、黏著斑通路、補體和凝血級聯反應、緊密連接通路、肌動蛋白細胞骨架調節、細胞外基質(ECM)-受體相互作用、碳水化合物消化吸收(圖4A)。如圖4B所示，差異蛋白主要富集在PI3K信號通路以及補體和凝血級聯反應通路(圖4B)。
圖4 KEGG富集分析和PPI網絡分析
為進一步明確差異蛋白之間的相互作用，我們對差異表達蛋白進行PPI網絡分析。如圖4C所示，差異表達蛋白被定位到兩個主要的功能相互作用網絡，與先天免疫相關的POP1-SURF6-RPL7L1-ISG15-CCL5-C5-C9-CFB-F5-APOB-IGFBP7以及與細胞周期和細胞成分相關的INCENP-KIF20A-PCLAF-ISG15-CCL5-IL18網絡。值得注意的是，這兩個網絡中至少有4個hub蛋白：ISG15、CCL5、GRWD1和C5(圖4C)。PPI網絡中，有5種存在較強相互作用的蛋白與免疫應答和PRV復制有關，分別是ISG15、CCL5、C5、C9和AFP。綜上所述，這些結果有助于闡明PRV與宿主之間的相互作用，并為PRV誘導的宿主免疫逃逸機制提供理論依據。
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