2021-11-02
期刊：《Chemical Engineering Journal》
影響因子：13.273
微生物基因組多組學聯合分析又雙叒叕添高分文章啦！
近日，派森諾生物與四川師范大學生命科學院趙甲元老師課題組攜手，在微生物基因組領域的《Chemical Engineering Journal》發表研究成果！依舊是經典的細菌完成圖測序+轉錄組測序+蛋白組測序+實驗端驗證的研究思路，每有文章刊載必是精品，還在等什么，快來get吧！
農藥在保障糧食安全方面發揮著重要作用，但對食品安全、生態保護和人類健康構成潛在威脅。通過微生物活性降解農藥，作為一種安全、環境友好、實用的消除農藥殘留的方法，越來越受到人們的關注。雖然已經從環境中分離出許多擬除蟲菊酯（一種農藥）降解微生物，并提出了幾種降解途徑，但總體而言，編碼擬除蟲菊酯及其代謝產物降解酶的基因仍有待研究。擬除蟲菊酯通常被認為是比毒性更強的有機氯和有機磷農藥更環保的替代品，其中β-氯氰菊酯（β-CY）占全國擬除蟲菊酯市場的50%以上。由于過量噴灑，β-CY殘留在水果和蔬菜、河流和土壤中均被檢測到，這可能對人類和環境建庫產生長期影響。本研究旨在研究從綿羊瘤胃食糜中分離的一種細菌GW-01（蠟樣芽孢桿菌）降解β-CY的相關酶基因以及代謝途徑。
02、研究材料與方法
1.實驗思路
2.實驗材料：
從甘肅武威市的5歲健康雌性小尾寒羊的瘤胃糜樣品中，通過共代謝分離得到β-CY降解菌株——蠟樣芽孢桿菌GW-01菌株。
3.測序平臺：
Illumina Miseq+Pacbio 、 Illumina HiSeq X Ten。
4.分析內容：
菌株形態和生理生化鑒定、細菌完成圖測序、轉錄組測序、蛋白組測序、代謝組產物檢測、基因克隆、載體構建及酶形態學分析等等。
03、研究結果
1.GW-01菌株的特性分析
顯微鏡觀察顯示菌株GW-01是一個革蘭氏陽性桿狀菌，在光鏡下產生出的孢子呈現圓形或柱狀的中生或亞中生孢子。在37℃的LB培養基上孵育24h后，形成圓形或近圓形、柔軟、無色素、直徑在5-7mm、微亮的白色菌落（圖1）。
圖1：菌株GW-01革蘭氏染色反應(a)、孢子染色(b)、LB瓊脂平板菌落形態(c)、血平板菌落形態(d)。
基于16S rRNA系統發育樹分析表明，菌株GW-01與Bacillus albus MCCC 1A02146, Bacillus luti MCCC 1A00359, Bacillus nitratireducens MCCC 1A00732和Bacillus tropicus MCCC 1A01406具有100%的相似性（圖2）。基于全基因組的ANI分析發現，菌株GW-01與蠟樣芽孢桿菌B4078的相似性值大于95%，則可說明GW-01菌株不是芽孢桿菌屬的一個新種。病毒菌株GW-01的β-CY降解活性的誘導性質進行鑒定，發現誘導樣品中膜組分對β-CY的降解顯著高于未誘導樣品（表1）。
圖2 基于16S rRNA構建的蠟樣芽孢桿菌GW-01與其相關菌株的系統發育樹和GW-01全基因組圈圖
表1 菌株GW-01 β-CY降解酶的誘導特性
2. 菌株GW-01生物降解β-CY特性研究
在100mg/L條件下，β-CY降解程度隨著時間增加而增加（圖3a），菌株GW-01的生物量在4d的時候達到最大值，而在5d后的生物量隨著β-CY初始濃度的增加而減少（圖3b），并在25mg/L的時候β-CY的降解量最大（87.6%）。以上結果表明，菌株GW-01降解β-CY的有效半衰期為4.49d（圖3c），在高濃度的情況下似乎有毒性的低生物量的β-CY存在。為了進一步研究這種毒性，檢測了菌株GW-01在不同濃度β-CY處理24h后的氧化應激反應，圖3d、e、f、g顯示了菌株GW-01的SOD、CAT、GST和T-AOC活性隨著β-CY濃度的增加而顯著升高。使用使用spearson相關分析分析了β-CY降解、菌株GW-01生物量、β-CY濃度和氧化應激參數之間的相關性(圖3 h)，發現生物量與β-CY初始濃度、GST和CAT活性呈負相關。這些結果表明，β-CY的初始濃度是誘導菌株GW-01毒性氧化應激的決定因素。
圖3：菌株GW-01對β - CY的降解及LB培養基中β - CY暴露后的氧化應激反應（a）不同時間β-CY降解（100mg/L）；（b）不同濃度β-CY處理5d后的降解程度；（c）GW-01在LB培養基中降解β-CY的一級降解動力學模型。0-200mg/L β-CY處理菌株GW-01 24h后，（d）SOD活性、（e）CAT活性、（f）GST活性、（g）T-AOC活性均顯著降低。（h）β-CY濃度、β-CY降解、菌株GW-01生物量、SOD活性、CAT活性、GST活性和GW-01中T-AOC的Spearson相關性分析
3. β - CY生物降解產物的鑒定
通過GC-MS和HPLC鑒定β-CY生物降解產物（圖4a），菌株GW-01的β-CY生物降解產物特征見表S3。圖4b、c、d、e、f、g、h和i分別顯示了GW-01對3-PBA、苯甲酸、苯酚和兒茶酚的降解情況。從圖中可以看出，除3-PBA的降解生物量外，GW-01的生物量以及3-PBA、苯甲酸、苯酚和鄰苯二酚的降解量在7d內均隨時間增加而增加。此外，隨著3-PBA和苯甲酸濃度的增加，生物量和3-PBA和苯甲酸的降解量降低。然而，在苯酚和兒茶酚降解過程中，觀察到相反的情況，17.0%和15.1%的降解率隨初始濃度的增加而增加。同時，對照組的生物量高于3-PBA、苯酚、苯甲酸和兒茶酚樣品(圖4c、e、g和i)，表明母質化合物和這些代謝物都對GW-01有毒。
圖4：β-CY在GW-01培養物中生物降解的代謝物(a)經GC-MS鑒定的β-CY生物降解產物。初始濃度分別為50 (c)、12.5 (d)、25 mg/L (f)、25 mg/L (h)的3-PBA、苯甲酸、苯酚和鄰苯二酚在7天內的生物降解時間歷程。5 d后，3-PBA (c)、苯甲酸(e)、苯酚(g)和鄰苯二酚(i)在不同濃度下的生物降解。
4. 組學分析
以菌株GW-01全基因組序列為基礎，對β-CY降解酶及其代謝產物的編碼基因和氧化應激相關蛋白進行轉錄組和蛋白組學分析。由于菌株GW-01能夠降解β-CY及其代謝產物，在培養和降解過程中積累了大量的代謝物，有利于誘導相關基因和蛋白的表達。因此，將菌株GW-01置于LB培養基中，100mg/L，30℃，150rpm中培養36h，獲得的細胞用于進一步研究。
4.1轉錄組學分析
轉錄組數據的初步統計分析顯示，復制中的基因表達模式和β-CY暴露呈現正相關（圖5a）。在菌株GW-01中，共差異表達434個基因，其中上調基因246個，下調基因188個（圖5b）。差異表達基因數量最多的是“轉運蛋白”，占上調基因的30.89%，其次是“糖酵解和糖質新生”（6.5%）和“丙酮酸代謝”（6.1%）（圖5c）。下調基因類別最多的是肽酶和抑制劑（11.17%）和群體感應（7.98%）相關基因（圖5d）。此外，參與檸檬酸循環(TCA循環)、運輸、碳水化合物代謝、谷胱甘肽代謝、苯甲酸降解、藥物代謝、細菌趨化性、丁酸代謝、核苷酸切除修復、DNA修復與重組蛋白、DNA復制蛋白、染色體和相關蛋白組也受到差異調節，表明這些組是細胞對β-CY及其代謝物直接反應的一部分，或者是與暴露相關的毒性反應。
圖5-1：轉錄組分析：（a）對照和處理樣本對應基因表達值的Pearson相關性。(b)差異表達基因火山圖(>變化2.0倍);縱坐標為KEGG條目，橫坐標為不同樣本的基因計數，不同顏色代表不同富集程度。(c)和(d)分別表達上調和下調的基因
4.2蛋白組學分析
在菌株GW-01中共鑒定到2546個蛋白，其中有331個蛋白上調，403個下調，此為對照組的1.2倍（圖5g）。通過使用層次聚類對重復進行分組，實驗重復性非常好（圖5e）。圖5h顯示了誘導組和對照組差異表達蛋白kegg通路顯著富集，過氧化物酶體、藥物代謝-細胞色素P450、細胞色度P450對外源藥物的代謝作用和丁酸代謝途徑均與β-CY的暴露相關。在GO注釋中可知，β-CY暴露對代謝過程、解毒、催化活性和抗氧化活性組的蛋白質有不同程度的調節（圖5f）。
圖5-2 蛋白組分析：（e）處理組和對照組中表達蛋白的分類聚類（f）β-CY處理誘導的蛋白質功能分類，分為生物過程(BP)、分子功能(MF)和細胞成分(CC)三類。條形圖上方的數字為富集因子，表示差異表達蛋白數量與GO標注的所有鑒定蛋白數量的比例。(g)差異表達蛋白火山圖(>變化2.0倍);縱坐標為KEGG條目，橫坐標為不同樣品的蛋白計數，不同顏色代表不同富集程度。(h)在處理組和對照組比較的基礎上，采用Fisher準確檢驗對差異表達蛋白對應的KEGG通路富集分析。
5. 基于多組學的降解基因聯合分析
轉錄組和蛋白組變化趨勢相同的基因的關聯性結果如圖6a所示，Pearson相關系數值為0.7956。表S4-A列出了在轉錄組和蛋白質組中均顯示富集的KEGG通路，其上調的類別包括乙醛酸和二醛酸代謝、丁酸代謝、丙酸代謝、核苷酸切除修復、TCA循環等；下調的基因的代謝通路包括：有機酸跨膜、有機物氧化、有機酸代謝過程、前提代謝產物和能量的產生等途徑。微生物降解β-CY和/或其代謝物的主要酶可能是水解酶、裂解酶、羥化酶、氧化酶和/或非特征蛋白。這些酶的表達上調和下調的基因見圖6b、c、d、f，功能見表S5。大量編碼類似功能的基因表明，它們的誘導是β-CY和/或其代謝物暴露誘導的廣義應激反應。一些上調的水解酶、氧化酶、羥化酶和裂解酶可能在β-CY及其代謝物的降解中發揮作用。根據KEGG和Swiss-Prot注釋，α/β水解酶(chr_3118)、金屬依賴型水解酶(chr_505)、氯水解酶(chr_1781)、細胞色素aa3喹啉氧化酶(chr_678、679、680)可能編碼β-CY及其代謝產物的降解酶。圖6e中出現與氧化應激相關的基因上調或下調，過氧化氫酶(chr_1126)、超氧化物歧化酶[Fe- Mn] (chr_5269)、羥?；入赘孰乃饷?chr_942)、乳基谷胱甘肽裂解酶(chr_3176)下調；超氧化物歧化酶[Cu-Zn] (chr_4757)、乳基谷胱甘肽裂解酶(chr_3048,960)、超氧化物歧化酶[Cu-Zn]、乳基谷胱甘肽裂解酶(chr_3048,960)、和5036)的表達上調，表明這些基因或蛋白的表達是由β-CY或其代謝物誘導的。
圖6：基于多組學的降解基因聯合分析。(a)具有相同變化趨勢的DEGs和DEPs之間的相關性，DEGs和DEPs編碼水解酶和裂解酶(b)、羥化酶(c)、氧化酶(d)、氧化應激酶(e)、轉錄組(外圈)和蛋白質組(內圈)中的非特征蛋白(d)。
6. 基于GW-01的β-CY轉化酶的克隆與鑒定
鑒于大量編碼相似功能的基因在β-CY暴露過程中存在差異表達，在5節中對酶進行了分析，以便進一步研究。β-CY及其代謝物降解，這些蛋白質根據表2所示，在體外實驗中，很明顯，α/β-水解酶基因(chr_3118)可以降低15.3%的β-CY(25 mg / L)， chr_1781 (氯水解酶)可以降低21.7%的苯酚(25 mg / L)。細胞色素aa3二酚氧化酶基因含有4個亞基，檢測了編碼3-PBA或3-苯氧基芐醇的單個亞基或這些亞基的混合蛋白對3-PBA或3-苯氧基芐醇的降解。該混合物對3-PBA (25 mg/L)的降解率為25.7%，但對3-苯氧基芐醇的降解率不高，而單個亞基不能降解3-PBA或3-苯氧基芐。通過GC-MS鑒定酶的降解產物，與氯水解酶編碼的蛋白(chr_1781)反應后，在苯酚樣品中檢測到鄰苯二酚(圖S3)。與α/β-水解酶基因(chr_3118)和細胞色素aa3喹啉氧化酶基因(chr_677, 678, 679, 680)編碼的蛋白反應后，樣品中未檢出產物。
04、研究結論
1. 菌株GW-01從健康母羊瘤胃中分離得到，其個體形態和菌落形態、生理和生理功能均具有顯著性差異；
2. 基于16S rRNA基因序列進行系統發育分析，全基因組比較表明該菌株為蠟樣芽孢桿菌；
3.不同時間段SOD、CAT、GST活性及T-AOC的變化，表明β-CY誘導小鼠產生氧化應激反應。β-CY的降解似乎是由于最初的酯酶反應，產生3-PBA，被代謝為苯酚和苯甲酸，而在菌株GW-01進一步降解為檸檬酸循環中間體。進一步的這4個基因的表達和活性分析，表明這些基因預測編碼的酶負責β-CY及其代謝產物的降解。
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