2021-10-20
期刊：《Science of the Total Environment》
影響因子：7.962
文章題目：Effects of contaminated surface water and groundwater from a rare earth mining area on the biology and the physiology of Sprague-Dawley rats
技術手段： RNA-seq等
派森諾生物與內蒙古科技大學攜手合作，于近期在《Science of the Total Environment》上發表了通過轉錄組探究污染因子對大鼠DNA損傷的分子機制。
稀土礦區位于中國北方內蒙古包頭市，是世界上最大的稀土礦床，近幾十年來，集約開采、精煉作業、尾礦庫處置導致該礦區出現了許多生態環境問題【1,2】。有證據表明，該礦區是中國惡性腫瘤特別是肺癌死亡率最高的地區之一【3,4】。越來越多的學者注意到地下水中的有毒化合物會在生物體內積累和放大，造成長期和慢性的毒理學效應，這是無法通過物理和化學分析方法檢測或評估的。因此，生物監測方法越來越受到重視和認可。因此，在本研究中，首先對稀土礦區地表水和地下水中的核心污染物成分進行了分析。然后從宏觀到微觀(器官-組織-細胞-染色體基因)構建SD大鼠遺傳損傷的定量表征分析。最后，確定了地下水污染致遺傳損傷的可能分子機制。
技術路線
1、水質成分調查
在研究區共采集了5個水樣。S1和S2分別作為主礦400 m和東礦300 m的地下水采集點，這是目前主要的兩個礦區。地表水位點(S3-S5)從近到遠進行排序，城市飲用水作為標準對照組(樣品S)。地下水污染的主要指標為重金屬和稀土元素含量高，地表水污染的主要指標為稀土元素、總氮和氨氮(NH4+ -N)含量高。
2、鼠肝臟DNA損傷作用的生物學評價
稱重并計算各器官系數，結果顯示，對肝臟的影響比對其他器官的影響更為顯著。進一步分析了金屬元素和稀土元素在肝臟中的積累，部分金屬元素(Mn、Ni、Cu、Zn、Cd)和稀土元素(Ce、Sc、Nd、Pr、Gd、Th)的富集差異極顯著(p< 0.01)。
通過對6個處理過的肝臟樣本進行免疫組織病理學分析，對照組無異常，而實驗組肝組織結構發生炎癥細胞浸潤，中心靜脈和膽管增生的改變，肝小葉中心靜脈充血。 特別地，與對照組相比，所有實驗組均發現肝臟細胞核大小和核漿不均勻，甚至出現核漿聚集，表明可能存在DNA損傷（圖1）。
圖1 地表水和地下水對SD大鼠肝組織損傷的評價
采集骨髓細胞，用彗星試驗檢測DNA鏈斷裂(圖5)。統計分析表明，所有實驗組的尾DNA %顯著增加(p值< 0.01)，隨著離主礦越近，尾DNA %呈增加趨勢。采用骨髓多染紅細胞微核試驗檢測染色體畸變，結果表明礦區周圍的地表水或地下水會對SD大鼠造成不同程度的染色體損傷。分析6份水樣核心污染成分與同一點處理SD大鼠尾DNA% 的相關性，結果發現，大鼠的DNA損傷是多重污染的，其相關污染因素主要集中在Mn、Co、Ni、Sc、Nb、La、Ce、Pr、Dy和Y。
3、DNA損傷的分子機制鑒定
為了進一步確定DNA損傷效應可能的分子機制，我們使用S1樣本處理的SD大鼠肝臟組織進行進一步研究，這些組織在之前的毒理學損傷檢測中明顯異常。通過高通量測序，共有114個差異表達基因(DEGs)，其中上調基因58個，下調基因56個(圖2A)。聚類分析熱圖如圖2B所示。結果發現2個腫瘤相關基因(Mmp8和Ltf)顯著上調，3個頻繁突變的免疫相關基因(Mpo, Slpi和Elane)顯著上調。此外，有趣的是，兩個DNA損傷相關基因(Ddit4和Gadd45g)的表達下調。
圖2差異表達基因火山圖（A）和聚類熱圖（B）
對差異基因進行富集分析，在GO富集分析中，DEG最多的GO term為細胞對含氧化合物的反應（圖3A）。KEGG富集分析的結果表明，腫瘤是最主要的途徑，其次是信號轉導、免疫系統、脂質代謝、免疫疾病等。此外，在細胞進程的類別下中富集最顯著的通路與吞噬體和p53通路相關，在環境信息過程中與化學致癌物相關(圖3B)。此外，蛋白質相互作用顯示了免疫、DNA損傷和代謝相關基因的大量連接，根據STRING數據庫進行分析，以揭示靶基因之間的功能關系(圖3C)。
圖3 差異表達基因的生物信息學分析
根據評分結果和DEGs的生物學功能，本研究中選擇了幾個參與免疫應答、癌癥應答、氧化應激應答和DNA損傷應答的基因成員進行RT-qPCR驗證。RNA-seq檢測和qPCR檢測的基因表達水平趨勢一致（圖4）。
圖4 RT-qPCR驗證mRNA-seq結果
實驗結論
綜合結果表明，一些金屬元素(Mn、Zn、Co、Ni)和稀土元素 (Sc、Nb、La、Ce、Pr、Dy和Y)可能對SD大鼠造成明顯的DNA遺傳損傷。DNA損傷的分子機制表明，DNA損傷誘導基因(Gadd45g和Ddit4)、免疫相關基因(Mpo、Slpi和Elane)和兩個腫瘤相關基因(Mmp8和Ltf)可作為一種新的預后和預測生物標志物進行生物安全性評價。總之，本研究不僅揭示了金屬元素和稀土元素可能造成的毒理學損傷的分子機制，而且為評價礦區周圍水污染風險提供了一種科學的評價方法。
本研究的RNA測序和分析由上海派森諾生物科技有限公司完成
