期刊：Journal of Agricultural and Food Chemistry
Transcriptomic and Metabolomic Analyses Provide Insights into the Enhancement of Torulene and Torularhodin Production in Rhodotorula glutinis ZHK under Moderate Salt Conditions
Journal of Agricultural and Food Chemistry
轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、代謝組檢測(cè)
派森諾生物與仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院攜手合作，于近期在Journal of Agricultural and Food Chemistry上發(fā)表了鹽脅迫對(duì)粘紅酵母的類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)量影響的研究成果。
類(lèi)胡蘿卜素是一組1100多種天然脂溶性色素分子，不僅可以用作天然著色劑，且具有促進(jìn)健康的功效，在制藥、食品、飼料和化妝品行業(yè)中已經(jīng)有廣泛的應(yīng)用。人類(lèi)無(wú)法合成類(lèi)胡蘿卜素，因此必須在食物中補(bǔ)充這些化合物。
粘紅酵母ZHK是一種含油脂的紅酵母，主要生產(chǎn)三種類(lèi)胡蘿卜素：圓酵母素、紅酵母紅素和β-胡蘿卜素。相較于β-胡蘿卜素，圓酵母素、紅酵母紅素的研究較少，近期有研究表明這兩種類(lèi)胡蘿卜素具有很強(qiáng)的抗氧化性能、且表現(xiàn)出較強(qiáng)的維生素A原和抗前列腺癌活性。因此進(jìn)一步提高圓酵母素和紅酵母紅素的產(chǎn)量具有商業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
盡管有大量的文獻(xiàn)介紹了環(huán)境因素對(duì)粘紅酵母中圓酵母素和紅酵母紅素生物合成效率的影響，但鹽脅迫的具體作用尚未研究。因此，本研究的主要目的是通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄組和代謝組的綜合分析，研究鹽脅迫對(duì)粘紅酵母ZHK產(chǎn)生圓酵母素和紅酵母紅素的影響，并確定其分子機(jī)制。
1、酵母培養(yǎng)條件：分別用濃度為0.5、0.75和1.0 M的NaCl培養(yǎng)粘紅酵母ZHK，生長(zhǎng)周期為120 h。在接種前加入終濃度為40 μM的二苯胺(DPA)以抑制胡蘿卜素的生成。
2、測(cè)定指標(biāo)：活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）
3、組學(xué)手段：轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、代謝組學(xué)分析
1、鹽脅迫對(duì)粘紅酵母ZHK生長(zhǎng)的影響
為了揭示不同NaCl濃度對(duì)粘紅酵母生長(zhǎng)的影響，分別在0、0.5、0.75、1.0和1.5 M NaCl濃度下培養(yǎng)粘紅酵母ZHK。為進(jìn)一步研究類(lèi)胡蘿卜素在黏菌ZHK耐鹽性中的作用，在培養(yǎng)基中選擇性添加40 μM類(lèi)胡蘿卜素生成抑制劑DPA。結(jié)果表明，添加DPA后，總類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)量由1.42 mg/L降低至0.16 mg/L。另外如圖1所示，NaCl處理顯著抑制了粘紅酵母ZHK的生長(zhǎng)。此外在0.5、0.75、1.0和1.5 M NaCl濃度下，添加40 μM DPA均導(dǎo)致了顯著的生長(zhǎng)抑制(圖1 B?E)。
該結(jié)果初步表明，細(xì)胞內(nèi)類(lèi)胡蘿卜素的合成有助于緩解高鹽對(duì)粘紅酵母ZHK的脅迫。
2、鹽脅迫對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS、SOD和CAT的影響
以往研究表明，在鹽脅迫下，ROS的穩(wěn)態(tài)會(huì)被打破，同時(shí)第一抗氧化機(jī)制，如SOD和CAT，則會(huì)被激活。為研究鹽脅迫下類(lèi)胡蘿卜素合成與抗氧化反應(yīng)的關(guān)系，在選擇性添加40 μM DPA的條件下，分別于0.75 M NaCl和、0 M NaCl培養(yǎng)基培養(yǎng)ZHK菌株120 h，然后檢測(cè)各組間細(xì)胞內(nèi)ROS、SOD、CAT水平的變化。結(jié)果如圖2所示，與對(duì)照組相比，0.75 M NaCl處理顯著提高了細(xì)胞內(nèi)ROS、SOD和CAT水平。在0.75 M NaCl處理下，添加40 μM DPA后，細(xì)胞內(nèi)ROS、SOD和CAT水平均顯著高于未添加DPA的水平。ROS、SOD或CAT水平與類(lèi)胡蘿卜素合成呈負(fù)相關(guān)。
這些結(jié)果表明，類(lèi)胡蘿卜素可能通過(guò)淬滅活性氧，在減輕由鹽脅迫引起的抗氧化反應(yīng)和氧化損傷方面發(fā)揮重要作用。
3、鹽脅迫對(duì)類(lèi)胡蘿卜素含量的影響
采用高效液相色譜法（HPLC）研究了鹽脅迫對(duì)培養(yǎng)120h后粘紅酵母ZHK類(lèi)胡蘿卜素含量的影響（圖3）。
從產(chǎn)量變化看，對(duì)于總類(lèi)胡蘿卜素而言，與對(duì)照相比，其產(chǎn)量在0.5 M和0.75 M NaCl處理中顯著增加，而在1.0 M NaCl處理中顯著降低；紅酵母紅素和β-胡蘿卜素產(chǎn)量的情況與之類(lèi)似；而對(duì)于圓酵母素而言，0.5 M和0.75 M NaCl處理使其產(chǎn)量顯著增加，而1.0 M NaCl處理下的產(chǎn)量無(wú)明顯變化。該結(jié)果證明，在中等鹽條件下，粘紅酵母的圓酵母素、紅酵母紅素產(chǎn)量較高。
而從三種類(lèi)胡蘿卜素占比來(lái)看，0.5 M、0.75 M和1 M NaCl處理下圓酵母素在總類(lèi)胡蘿卜素中的相對(duì)比例均顯著高于對(duì)照；然而，與對(duì)照相比，當(dāng)暴露在鹽脅迫下時(shí)，紅酵母紅素的比例卻逐漸下降；β-胡蘿卜素的情況與之類(lèi)似：0.5和0.75 M NaCl處理雖然提高了β-胡蘿卜素的產(chǎn)量，但顯著降低了其在總類(lèi)胡蘿卜素中的相對(duì)比例。
綜上所述，中度鹽脅迫(0.5和0.75 M)可顯著增加粘紅酵母的類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)量，尤其是圓酵母素和紅酵母紅素。
4、 響應(yīng)鹽脅迫的差異表達(dá)基因
為了鑒定在0.75 M NaCl脅迫下粘紅酵母ZHK中的差異表達(dá)基因，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)果表明，與對(duì)照相比，鹽脅迫下共有1829個(gè)基因發(fā)生表達(dá)差異，其中840個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，989個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。特別地，差異基因中檢索到與胡蘿卜素合成相關(guān)的基因（圖4 C）：atoB、FDPS、crtE、crtI等，此外，啟動(dòng)子分析顯示（圖4 D），atoB、FDPS和crtI在其啟動(dòng)子中被發(fā)現(xiàn)含有轉(zhuǎn)錄因子SP1的共同序列基元(GCCCCKCCCCC)，這些胡蘿卜素基因可能受到同一轉(zhuǎn)錄因子SP1的調(diào)控。
進(jìn)一步對(duì)差異基因進(jìn)行富集分析。GO富集分析結(jié)果顯示（圖4 A），在CC類(lèi)別中，富集程度最高的三個(gè)GO條目分別是甘露糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物(GO:0031501)、微體部分(GO:0044438)和過(guò)氧化物酶體部分(GO:0044439)；在BP類(lèi)中，GO條目顯著富集的前三個(gè)階段分別是硫化合物代謝過(guò)程(GO:0006790)、二羧酸代謝過(guò)程(GO:0043648)和有機(jī)羥基化合物代謝過(guò)程(GO:1901615)；在MF類(lèi)別中，富集程度最高的GO條目分別是金屬簇結(jié)合(GO:0051540)、鐵-硫簇結(jié)合(GO:0051536)和受體結(jié)合(GO:0005102)。
KEGG富集分析結(jié)果顯示（圖4 B），鹽脅迫下的DEGs在328條通路中富集。與耐鹽性相關(guān)的途徑主要?dú)w為氨基酸代謝和碳水化合物代謝，如“苯丙氨酸代謝(ko00360)”、“酪氨酸代謝(ko00350)”、“丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝(ko00250)”等。
為評(píng)估鹽脅迫下代謝變化的概述，使用LC - MS/MS進(jìn)行了代謝組學(xué)分析。主成分分析(PCA)和PLS-DA模型顯示ST（鹽處理）組和CK組相互分離(圖5 A、B)?；贛S2譜數(shù)據(jù)庫(kù)的分析顯示所有樣品之間共注釋了497個(gè)代謝物。其中差異累積代謝物96個(gè)，上調(diào)代謝物54個(gè)，下調(diào)代謝物42個(gè)(圖5 C)。
然后對(duì)差異積累代謝物進(jìn)行KEGG富集分析（圖5 D）。結(jié)果顯示，鹽脅迫下的差異積累代謝產(chǎn)物富集到34條通路，值得注意的是，代謝組中最顯著富集的KEGG通路與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果高度一致，均屬于氨基酸代謝和碳水化合物代謝大類(lèi)。
最后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄-代謝聯(lián)合分析，利用Pearson相關(guān)系數(shù)>0.99和p-value <0.01兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖（圖5 E）。結(jié)果顯示，在鹽脅迫響應(yīng)中，有71個(gè)差異表達(dá)基因(29個(gè)上調(diào)，42個(gè)下調(diào))和29個(gè)差異積累代謝物(17個(gè)上調(diào)，12個(gè)下調(diào))密切相關(guān)。其中，差異基因：R. glutinis_g05971、R. glutinis_g03041、R.glutinis_G05970、R. glutinis_g06656、R. glutinis_G03640以及差異積累代謝物：ADP、L-谷氨酸、丙酮酸、谷胱甘肽、二氫玉米素、L-谷氨酰胺，可能在鹽脅迫反應(yīng)中起中樞調(diào)控作用。
?本文研究了不同鹽條件對(duì)粘紅酵母胡蘿卜素產(chǎn)量的影響。
?結(jié)果表明，在培養(yǎng)120 h后，中度鹽脅迫(0.5和0.75 M NaCl) 處理的類(lèi)胡蘿卜素總量顯著高于高度鹽脅迫（1.0 M NaCl)和對(duì)照。
?其中，圓酵母素和紅酵母紅素的增加是類(lèi)胡蘿卜素總量增加的主要原因。
?轉(zhuǎn)錄組分析表明，鹽脅迫可有效促進(jìn)crtI基因的表達(dá)，這可以解釋鹽脅迫下類(lèi)胡蘿卜素和紅酵母紅素產(chǎn)量增加的分子機(jī)制。
?進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，類(lèi)胡蘿卜素、紅酵母紅素在抑制鹽脅迫引起的異?；钚匝踔衅鹬匾饔?。
?本研究結(jié)果為通過(guò)基因操作提高粘紅酵母耐鹽性、進(jìn)一步提高產(chǎn)圓酵母素、紅酵母紅素合成效率奠定了理論基礎(chǔ)。
本研究的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和代謝組檢測(cè)及相關(guān)數(shù)據(jù)分析工作由上海派森諾生物科技有限公司完成。
