2021-09-27
發(fā)表雜志：Cancer Discovery
影響因子：39.397
發(fā)表時間：2021年8月22日
高通量測序方法：單細胞測序，空間轉錄組測序，轉錄組測序
樣本設置：13例未治療病例的54個樣本，6例新輔助化療有療效病例的30個樣本，5例新輔助化療無療效病例的13個樣本，共計89個樣本，進行單細胞測序；2個新輔助化療有療效病例的結直腸癌和肝癌組織共4個樣本和2個新輔助化療無療效病例的結直腸癌和肝癌組織共4個樣本，共計8個樣本，進行空間轉錄組測序；430個病例的單細胞測序
取樣部位：結直腸癌的癌和癌旁組織；肝轉移的癌和癌旁組織；淋巴組織，PBMC
研究思路
主要研究結果
1、單細胞測序和空間轉錄組測序準確量化結直腸癌肝轉移的免疫細胞
對20個病例的89個樣本進行單細胞測序，共捕獲178,630個CD45+細胞，鑒定到髓系細胞，CD8+ T細胞，CD4+ T細胞，NK細胞和B細胞等幾大類。其中，T細胞在不同組織類型里不同類別細胞的比例差異較大，顯示了組織間的免疫異質性。通過4個病例的8個樣本的空間轉錄組測序，并結合單細胞測序結果，可量化不同免疫細胞亞群。在未治療的樣本中，CD8+ T細胞在結直腸癌和肝轉移的樣本中，均有高度富集。經新輔助化療治療的樣本，腫瘤區(qū)域減少。空間轉錄組測序整合單細胞測序分析，可以在空間范圍內定量呈現(xiàn)不同系吧類別的比例和空間分布，為解析空間范圍的免疫微環(huán)境提供更全面的數據。
2、MRC1+ CCL18+ 巨噬細胞在轉移腫瘤中高度富集
作者隨后分析了各類免疫細胞在各個組織中的相對含量，顯示不同部位的免疫細胞類別和豐度差異較大。某些免疫抑制細胞，如PDCD1+ CD4+ T細胞和CTLA4+ CD8 + T細胞，在結直腸癌和肝轉移腫瘤中豐度相當，而SPP1+巨噬細胞和MRC1+CCL18+巨噬細胞在肝轉移腫瘤中豐度更高。隨后，通過27人的隊列進行多色免疫熒光驗證，已經133人的隊列進行基因芯片分析，獲得了一致的結果。利用TCGA的430人的隊列的RNAseq數據，進行預后分析，顯示SPP1+巨噬細胞和MRC1+CCL18+巨噬細胞與預后負相關。
通過比較case與control之間的細胞數目的差異，關注到SPP1+巨噬細胞和MRC1+CCL18+巨噬細胞，通過大隊列的驗證，證明這兩類細胞在大范圍人群中普遍存在，通過TCGA數據庫進行預后分析，暗示挑選細胞可能是解釋疾病的關鍵細胞類群。通過這樣的思路篩選出來的細胞類群，后續(xù)進行深入的分析。
3、SPP1+巨噬細胞和MRC1+CCL18+巨噬細胞的功能
首先通過細胞通訊分析各類免疫細胞和腫瘤細胞的細胞間通訊，結果顯示，SPP1+巨噬細胞和MRC1+CCL18+巨噬細胞與腫瘤具有非常強的通訊，并且，兩者的通訊是通過CD47和SIRPA進行通訊的，并利用多色免疫熒光驗證這兩類細胞定位于相同的空間區(qū)域。隨后，比較了結直腸癌和肝臟轉移的樣本這兩類細胞的差異表達基因及其信號通路，結果顯示肝轉移腫瘤組織的SPP1+巨噬細胞和MRC1+CCL18+巨噬細胞代謝相關的信號通路高度富集。
通過細胞通訊分析，關注到特定的基因，后續(xù)可以通過生物學驗證，驗證ligand或receptor參與該生物學過程的機制（詳細實驗設計方案，可參考公眾號文章【單細胞測序+外顯子測序+轉錄組測序+免疫組化+免疫熒光+流式+WB+細胞實驗+預后分析】多組學聯(lián)合解析膽囊癌免疫逃逸機制）。此外，關注到代謝相關的信號通路高度富集，可以通過代謝組學測定進行驗證（關于單細胞測序和代謝組測序聯(lián)合分析方案，請聯(lián)系您的派森諾銷售顧問，派森諾為您提供個性化解決方案）。本文采用了第三種方案，研發(fā)了ScMetabolism算法，深入分析單細胞測序數據的代謝通路，為科學研究提供更多的技術支持。
4、ScMetabolism分析鑒定到肝轉移腫瘤中MRC1+CCL18+巨噬細胞代謝大大增強
ScMetabolism分析顯示MRC1+CCL18+巨噬細胞有42條代謝通路上調，其代謝相關基因的表達，也大大提高。此外，作者也做了MRC1+CCL18+巨噬細胞的geneset score分析，包括抗原呈遞，血管形成，免疫抑制等，進一步分析關注細胞的功能。
5、新輔助化療有效和無效的免疫微環(huán)境差異
為了探索新輔助化療的抗腫瘤療效，作者對CD45+細胞進行了聚類分析，結果顯示結直腸癌和肝轉移腫瘤的細胞類別存在較大差別。為分析新輔助化療對細胞的影響，分析了不同類別的差異表達基因，在有療效的病例中，免疫抑制細胞減少，殺傷性細胞增多。在肝轉移腫瘤中，MRC1+CCL18+巨噬細胞和SPP1+巨噬細胞巨噬細胞均減少。而在無療效的病例中，這兩類細胞的數目增多，殺傷性T細胞的數目減少。
6、新輔助化療影響巨噬細胞的代謝
鑒于新輔助化療主要影響髓系細胞，尤其是巨噬細胞，因此，新輔助化療是否影響巨噬細胞的演化，是一個隨即提出的問題。對不同組的擬時序分析結果顯示，有療效的病例富含演化軌跡上早期的單核細胞，而缺少演化末端的巨噬細胞，如MRC1+CCL18+巨噬細胞和SPP1+巨噬細胞；而無療效的病例這兩類細胞的含量大大增加。通過對27個病例的多色免疫熒光，進一步驗證MRC1+CCL18+巨噬細胞和SPP1+巨噬細胞在有療效的病例中浸潤減少。ScMetabolism分析顯示有療效的病例的髓系細胞代謝下調。
擬時序分析可以把case和control放在一個演化軌跡上分析，比較case和control是否存在不同的演化軌跡，在更多的情況下，比較兩者在演化軌跡上的細胞數目的差異。
7、多病灶腫瘤的免疫異質性
多病灶腫瘤在腫瘤疾病中非常常見，不同病灶的免疫微環(huán)境異質性，以及其對新輔助化療的響應，目前還不清楚。作者分析4個多病灶病人的不同病灶，顯示不同病灶的免疫微環(huán)境差異顯著，免疫抑制細胞，如MRC1+ CCL18+的細胞在不同病灶的浸潤差異顯著。
總 結
本文做了89個單細胞和8個空轉，并結合大隊列的驗證，為結直腸肝轉移提供了詳盡的圖譜，并通過比較新輔助化療治療療效差異的不同病例，解析新輔助化療的作用機制。對于全景的描繪，最終聚焦到兩類巨噬細胞，分析細胞數目、基因表達差異、信號通路分析，最終將圖景式的描繪，聚焦到分子水平的機制解析，為單細胞測序數據挖掘，提供思路參考。更重要的，本文將信號通路分析聚焦到代謝通路，為臨床研究提供靶向藥物篩選的依據。
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