2021-09-17
將單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)與數(shù)據(jù)集成算法相結(jié)合，研究雞心從早期到晚期四腔心階段的發(fā)育。對發(fā)育中的心臟、它們的空間組織以及它們在發(fā)育過程中的相互作用進(jìn)行了多種細(xì)胞譜系的分析。心臟譜系分化轉(zhuǎn)變的空間映射定義了心外膜譜系內(nèi)上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)錄差異。使用空間分辨表達(dá)分析，確定了解剖學(xué)上受限的表達(dá)過程，包括與先天性心臟病有關(guān)的基因的表達(dá)。最后，發(fā)現(xiàn)了在整個冠狀血管發(fā)育過程中，分泌的小肽胸腺素 β-4 持續(xù)富集。總的來說，該研究確定了細(xì)胞分化和形態(tài)發(fā)生之間錯綜復(fù)雜的相互作用。
單細(xì)胞空間轉(zhuǎn)錄組研究背景
心臟是第一個發(fā)育的全功能器官，對胚胎發(fā)生至關(guān)重要。心臟發(fā)生涉及來自多個譜系的異質(zhì)細(xì)胞群，這些細(xì)胞群在時空上相互作用以驅(qū)動心臟命運(yùn)決定。雞胚胎被用作心臟發(fā)生模型系統(tǒng)，因?yàn)殡u蛋中的子宮外發(fā)育允許特殊的早期心臟發(fā)生階段，雞心臟解剖結(jié)構(gòu)類似于人類心臟解剖結(jié)構(gòu)的許多方面。在四個關(guān)鍵心室發(fā)育階段（HH21-HH24、HH30-HH31、HH35-HH36 和 HH40）生成了超過 22,000 個單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。數(shù)據(jù)包括常見和罕見的細(xì)胞類型，包括來自多個譜系的祖細(xì)胞和成熟細(xì)胞類型。此外，在相同的四個階段對總共 12 個心臟組織切片進(jìn)行了空間分辨的 RNA-seq。
單細(xì)胞+空間轉(zhuǎn)錄組研究結(jié)果
1.心臟組織細(xì)胞類型鑒定
生成了 22,315 個細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和 12 個組織切片的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，覆蓋了 6800 多spots。在同一發(fā)育階段收集的空間轉(zhuǎn)錄組和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組強(qiáng)相關(guān)（Pearson相關(guān)；R >0.98）從心室中的心肌、心內(nèi)膜和心外膜心臟譜系中鑒定出不同的細(xì)胞簇（圖 1d）。除了心臟細(xì)胞類型外，還檢測到少量紅細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞。最后，確定了一種特殊的異質(zhì)細(xì)胞群，它們表達(dá)高水平的胸腺素 β-4 ( TMSB4X )。
2. 時空譜系分析確定心臟祖細(xì)胞的異質(zhì)性
使用了軌跡重建工具PHATE7和scRNA-seq 數(shù)據(jù)中的擬時序分析，將它們放置在與細(xì)胞分化相對應(yīng)的軌跡上，通過估計局部 PHATE1 維度將有關(guān)從 scRNA-seq 的細(xì)胞轉(zhuǎn)變的信息空間投影到空間圖上。來自心室游離壁的 5,621 個心外膜細(xì)胞的聚類確定了五個主要細(xì)胞群：一個早期心外膜祖細(xì)胞群 (C1)、兩個中間前體細(xì)胞群 (C2 和 C3)、一個成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞群 (C4) 和一個壁畫細(xì)胞簇（C5）（圖 2b，左圖）。簇 C1 中的細(xì)胞主要來自 HH24（第 4 天）心室并表達(dá)典型的心外膜祖細(xì)胞標(biāo)志物，例如轉(zhuǎn)錄因子 21 ( TCF21 ) 9、t-box 轉(zhuǎn)錄因子 18 10 ( TBX18 ) 和 Wilm 瘤 1 ( WT1 ) 11。還表示視黃酸的信令相關(guān)的轉(zhuǎn)錄物的醛脫氫酶12，13（ALDH1A2），參與心外膜發(fā)展公知的信號傳導(dǎo)途徑（圖 2b中，左和右）。最后，這些細(xì)胞顯示出中期因子 ( MDK )的富集表達(dá)，這是另一種視黃酸信號相關(guān)轉(zhuǎn)錄物和生長因子14，之前并未涉及心外膜發(fā)育。
3. 先天性心臟病 (CHD) 相關(guān)基因在空間上的表達(dá)
進(jìn)一步探索空間 RNA-seq 數(shù)據(jù)集，以識別先天性心臟病 (CHD) 相關(guān)基因表達(dá)的時空模式。已發(fā)現(xiàn)超過 50 種人類基因的功能喪失顯性突變與 CHD 相關(guān)，調(diào)控的水平可以預(yù)測有可能是冠心病的基因型和表現(xiàn)型之間的強(qiáng)相關(guān)性。對涉及 CHD 的基因進(jìn)行空間 RNA-seq 分析，發(fā)現(xiàn)GATA5等關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)在瓣膜區(qū)域富集，IRX4 表達(dá)僅限于心室組織，TBX5在左心室富集（圖 4a-b和圖 3d）。PITX2基因是早期板中胚層側(cè)向性的主要調(diào)節(jié)因子，是確定器官側(cè)向性的關(guān)鍵成分，如預(yù)期的那樣在心臟左側(cè)富集（圖 4c）。CHD 相關(guān)肌節(jié)蛋白編碼基因如ACTC1和GJA5 的表達(dá)在心房和心室組織中均富集，但MYH7僅限于心房（圖 4d-f）。
4. 冠狀血管細(xì)胞中胸腺素β-4表達(dá)的富集
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的無監(jiān)督聚類鑒定了富含TMSB4X的異質(zhì)細(xì)胞簇，其中包含來自所有四個發(fā)育階段的細(xì)胞，首先從該簇中重新聚類 1075 個TMSB4X高細(xì)胞并檢查其細(xì)胞類型組成（圖 5a）。發(fā)現(xiàn)簇1主要由表達(dá)TCF21的心外膜細(xì)胞和表達(dá)心內(nèi)膜標(biāo)志物IRX6 42和NPC2 43 的心內(nèi)膜細(xì)胞組成（圖 5a，右）。簇 2 主要由差異表達(dá)ACTA2的血管壁細(xì)胞組成（圖 5a，右）。簇3主要由差異表達(dá)FABP5和TM4SF18的冠狀血管內(nèi)皮細(xì)胞組成（圖 5a，右）。TMSB4X發(fā)現(xiàn)在空間 RNA-seq 數(shù)據(jù)的后期階段富含瓣膜和心室壁。TMSB4X高細(xì)胞簇的差異基因表達(dá)分析確定了與細(xì)胞骨架組織相關(guān)的基因（波形蛋白（VIM）、Rho GTPase（RHOA）、肌動蛋白β（ACTB）、肌動蛋白γ1（ACTG1）和Destin 肌動蛋白解聚因子）的顯著上調(diào)( DSTN ))（圖 5b）。總之，結(jié)合空間分辨轉(zhuǎn)錄組學(xué)和成像數(shù)據(jù)表明，TMSB4X在所有細(xì)胞類型中普遍表達(dá)，但從冠狀血管系統(tǒng)發(fā)育的開始到心室發(fā)育過程中冠狀血管系統(tǒng)的成熟，在冠狀血管細(xì)胞內(nèi)富集。
單細(xì)胞+空間轉(zhuǎn)錄組總結(jié)討論
單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)相結(jié)合，創(chuàng)建了發(fā)育中的雞心細(xì)胞譜系的分層圖。該數(shù)據(jù)集跨越四個發(fā)育階段、22,315 個單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和 12 個空間基因表達(dá)圖，證明了細(xì)胞分化和形態(tài)變化是如何同時發(fā)生的。在過去的十年中，胸腺素 β-4 在心臟發(fā)育中的作用一直備受爭議。胸腺素 beta-4 的心肌細(xì)胞特異性和內(nèi)皮特異性 shRNA 敲低已被證明會導(dǎo)致心臟異常，但未發(fā)現(xiàn)整體、心肌細(xì)胞特異性和內(nèi)皮特異性敲除的異常，深入了解β-胸腺素及其代償機(jī)制如何影響心室發(fā)育過程中特定心肌細(xì)胞類型的生物學(xué)過程，有助于發(fā)現(xiàn)心肌梗死和先天性心臟病的治療方法。
更多技術(shù)資訊，請關(guān)注派森諾官網(wǎng)
