2021-09-14
期刊：Chemosphere
影響因子：7.09
文章題目：Integrative analyses of transcriptomics and metabolomics in Raphidocelis subcapitata treated with clarithromycin
技術手段：RNA-Seq、LC-MS代謝組學
派森諾生物與西北大學攜手合作，于近期在《Chemosphere》上發表關于羊角月牙藻經過克拉霉素處理后的轉錄組學和代謝組學聯合分析的相關研究成果。
研究背景
人類濫用抗生素導致其能夠在全球天然水域廣泛檢測到，鑒于抗生素對水生生物的潛在生態風險，其已被視為新興污染物?？死顾兀–LA）作為世界范圍內常用的大環內酯類抗生素之一，可以抑制多種廣譜生物、病原體和細菌的活性。已有研究表明，CLA對藻類具有很強的毒性，其排放到水生環境中可能對水生生物產生不利影響?？股刂荚诎邢蛏矬w（如細菌）中的受體或生化途徑。然而，類似的受體或途徑也可能存在于非目標生物中，例如藻類。作為水生食物鏈的主要生產者，藻類在提供多種生態功能方面發揮著重要作用，包括固碳、物質輸出和有毒物質積累。
羊角月牙藻（Raphidocelis subcapitata）在全球廣泛分布、有可用的基因組和較短的生長周期，并且是世界范圍內用于毒理學測試和風險評估的藻類模式物種。因此，本研究將羊角月牙藻作為試驗生物。已報道從轉錄組和代謝組水平揭示了環境脅迫對藻類的影響，但目前還沒有通過轉錄組學和代謝組學分析來闡明CLA在藻類中的作用機制。本研究旨在研究不同濃度CLA對羊角月牙藻的轉錄組學和代謝組學的影響，結果可以為藻類如何應對水生環境中的抗生素污染提供新的見解。
研究方法
羊角月牙藻分別在7種不同濃度的CLA中培養，濃度分別為0、3、10、15、20、25和40μg/L。生長抑制試驗持續7天，分別于0、2、4、7天對細胞數量進行統計。7天后，收集對照組（0μg/L）、低CLA組（3μg/L）、中CLA組（10μg/L）、高CLA組（15μg/L）進行轉錄組測序，并根據轉錄組測序結果，挑選關鍵差異基因進行qRT-PCR驗證；挑選對照組、低CLA組、中CLA組進行代謝組學分析。
研究結果
1.CLA對羊角月牙藻生長的影響
不同濃度的CLA處理7天后，羊角月牙藻的生長情況如圖1所示。與對照組相比，除了低CLA組（3μg/L）外，其他CLA處理組的生物量均受到顯著抑制。
圖1 不同濃度CLA處理7天后的羊角月牙藻生長曲線
2.差異表達基因
在羊角月牙藻所有處理組中共檢測到13383個轉錄本。基因表達模式表明，每個處理組的3次重復具有較高的相關性，相關系數大于0.97（圖2A）。PCA分析顯示，對照組的基因表達簇與低處理組接近，而中處理組和高處理組明顯不同（圖2B），在聚類熱圖中也發現了類似的結果（圖2C）。與對照組相比，低、中、高CLA組分別檢測到上調差異基因29、480、549個，下調差異基因19、155、410個（圖2D）。
圖2 不同濃度的CLA處理后，羊角月牙藻的轉錄組分析
3.GO、KEGG富集分析
在GO分析中，低、中、高CLA處理組分別富集了59、144和123個GO條目。為了確定CLA影響的代謝途徑，對所有差異表達基因進行KEGG分析。結果顯示，共有17個代謝途徑顯著富集，包括氨基酸代謝和糖代謝等途徑（表1）。
表1 CLA處理后，各處理組與對照組相比顯著富集的代謝通路
4.代謝組學分析
在正離子和負離子模式下分別檢測出426和408個代謝物。與對照組相比，在正離子模式下，低、中處理組分別鑒定出77和36個差異代謝物；在負離子模式下，低、中處理組分別鑒定出134和84個差異代謝物。
5.差異代謝物的KEGG富集分析
在代謝水平上，對所有差異代謝物進行KEGG富集分析，以確定受影響的途徑。圖3顯示了各組中前10個顯著相關的途徑。其中，代謝途徑、次生代謝產物的生物合成、檸檬酸循環(TCA循環)和雙組分調節系統在低、中處理組均富集。此外，乙醛酸和二羧酸代謝、氧化磷酸化和光合作用僅在低處理組富集。
圖3 差異代謝物的KEGG通路富集分析
6.轉錄組學和代謝組學聯合分析
聯合分析結果顯示，有7種化合物的轉錄本和代謝物之間存在一致性，包括：胞嘧啶核苷二磷酸（CDP）、腺嘌呤核苷二磷酸（ADP）、正磷酸鹽/磷酸鹽、丙酮酸、L-谷氨酸、甘油磷酸、甲基硫腺苷。這些化合物大多與ABC轉運體、氧化磷酸化、光合作用、光合生物固碳和萜類主鏈生物合成等多種途徑有關。
討 論
已知CLA在濃度為20μg/L和40μg/L時可顯著抑制羊角月牙藻的生長，而在濃度為5μg/L時未發現有害的影響，這與本研究一致。據報道，CLA在自然條件下，在不同的環境介質中具有高度的持久性，因此，在試驗過程中，CLA光降解和生物降解不太可能發生。作者將差異基因和差異代謝物在生物過程中包括異生物質代謝、光合作用、氧化磷酸化和光合色素合成進行了討論。
1.與異生物質代謝有關基因
在藻類細胞中，外源性化合物經過三個解毒階段(即轉化、偶聯和分隔)。本研究中參與這三個階段的變化基因有細胞色素P450 (Cyt P450)、細胞色素b5、醛脫氫酶(Aldh)、甲基轉移酶(MT)和ABC轉運蛋白家族基因。本研究中細胞色素b5和MT的上調有助于低處理組的羊角月牙藻代謝CLA；雖然在中度處理組中aldh、MT和ABC轉運體家族基因上調，但可能不足以代謝全部CLA；CLA高處理組中cyt P450和MT的表達下調，可能抑制了羊角月牙藻的解毒能力。
2.與光合作用相關的聯合分析
在本研究中，lhca4、lhca5、lhcb1、lhcb2、lhcb4等DEGs均與葉綠素光捕獲蛋白復合物相關。其中，lhcb1、lhcb2、lhcb4在中、高處理組均上調，說明激發態的捕光天線蛋白增強了細胞捕獲光的能力。然而，捕光天線的過度激發和強光也可能導致反應性化合物的形成，這可能會破壞整個光合單元（圖4）。
3. 與氧化磷酸化相關的聯合分析
在真核細胞中，氧化磷酸化是通過氧化某些代謝物和形成三磷酸腺苷(ATP)來釋放能量的一種有效途徑。代謝水平上，低處理組琥珀酸、延胡索酸、ADP和氧化磷酸化中磷酸的含量均升高，而在中處理組降低，相應的基因ppa、sdha和sdhb的表達趨勢相似（圖5）。Sdha和sdhb都與琥珀酸脫氫酶(SDH)的合成有關，SDH能夠通過在FAD結合位點上還原O2的單價電子產生ROS。由此可見，低處理組某些代謝物氧化釋放能量的能力增強，而中處理組被抑制，抑制SDH可能是誘導ROS產生的原因。
4.光合色素合成的聯合分析
類胡蘿卜素在植物的發育、光合作用和植物激素的產生中發揮著至關重要的作用。在本研究中，β-胡蘿卜素羥化酶(crtz)在低處理組顯著上調，中處理組類胡蘿卜素合成的降低可能降低了藻細胞對ROS的抗性。高CLA處理組中參與將5-氨基乙酰丙酸前體轉化為葉綠素a、b的一系列基因，包括heml、hemb、hemc、heme、hemf、hemy、por和dvr的表達水平降低(表1)，由于葉綠素a和b的降低，藻類的抗氧化能力可能會減弱，導致藻類細胞能量不足，降低其對ROS損傷的抵抗力。
圖4 光合作用相關的聯合分析
圖5 氧化磷酸化相關的聯合分析
文章小結
10μg/L和15μg/L濃度的CLA，經過7天處理后可顯著影響羊角月牙藻的生長，而濃度為3μg/L的處理則無顯著影響。轉錄組學和代謝組學聯合分析表明，三種CLA處理組的羊角月牙藻的反應機制不同。在3μg/L中，類胡蘿卜素生物合成基因的表達上調使羊角月牙藻對CLA具有足夠的抗性。相反，10 μg/L和15 μg/L對羊角月牙藻的外生代謝、電子傳遞和能量合成均有負面影響。為了補償損失的部分能量，藻類可以通過增加光合作用，通過反饋和調節機制獲得更多的能量。然而，捕光天線的過度激發和強光也可能導致ROS的形成，對細胞造成損傷。同時，類胡蘿卜素和葉綠素a、b合成基因的表達下調可能會進一步降低羊角月牙藻對CLA的抗性。
本研究中轉錄組和代謝組的檢測與數據分析以及轉錄組、代謝組聯合分析工作由上海派森諾生物科技有限公司完成。
